ASA处理对采后苹果霉心病控制 及活性氧代谢的诱导

邓惠文,赵 磊,王锦锋,王应强

(1.陇东学院农林科技学院,甘肃庆阳 745000;2.陇东学院机械工程学院,甘肃庆阳 745000)

霉心病是严重的苹果采后侵染性病害,分为腐烂型、霉心型和褐变型[1]。霉心病在果实成熟期和贮藏期以粉红单端孢(Trichotheciumroseum)侵染引起的腐烂型为主,主要症状表现为苹果胴部出现褐色、水渍状和不规则湿腐斑,斑块逐渐相连成片,果实心室组织和部分果组织腐烂[2]。富士苹果是我国种植面积最大的苹果品种,也是极易感霉心病的品种[1,3]。由T.roseum侵染引起的霉心病明显降低富士苹果的产量和品质,造成果实采后贮藏期间烂损[4]。目前,主要通过化学合成杀菌剂控制霉心病,但长期使用,其杀菌功效降低[5-6],还会引起环境污染,影响人类健康等[7]。

乙酰水杨酸(ASA)是水杨酸(SA)的衍生物,在植物体内很容易转化为SA,可提高植物对多种非生物胁迫的抗性[8]。SA能够作为一种信号分子参与植物系统性抗病反应,诱导多种植物获得抗病性[9-10]。近年来,SA被广泛应用于提高果蔬采后抗病性,例如SA可有效控制厚皮甜瓜的粉霉病[11]、芒果的炭疽病[12]、苹果的轮纹病[13]。目前为止,尚未见到ASA处理对T.roseum引起的富士苹果霉心病控制的相关报道。前期预实验采用0.5、1、2、4 mmol/L ASA处理苹果观察其对霉心病的控制效果,结果表明，2 mmol/L ASA处理对创伤接种T.roseum苹果的果心和果肉的控制效果较好。

本实验以“红富士苹果”为材料,研究采后ASA浸泡处理对富士苹果果肉部分损伤接种T.roseum之后的病斑直径、自然发病率的影响,探索ASA处理对活性氧代谢相关酶活性及代谢产物积累的影响,旨在为ASA在采后苹果霉心病病害控制中的应用及其作用机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红富士苹果 于2016年9月采自甘肃省庆阳市西峰区温泉乡,挑选无机械和病虫害伤、大小均一、7～8成熟度的果实于常温(22±2) ℃、相对湿度50%下贮藏待用;供试粉T.roseum分离于自然发病的富士苹果,在马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)上保存待用;ASA 分析纯,天津市光复精细化工研究所生产;聚乙烯吡咯烷酮(PVPP) 上海宝曼生物技术有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA) 北京普博斯生物有限公司;NADPH、α-萘胺、盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、四氯化钛、XTT、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、丙酮、H2O2、氨水、硫酸、盐酸 均为国产分析纯。

UV-2550紫外可见分光光度计 日本岛津;Thermo8600超低温冰箱 杭州明凯科技有限公司;TGL-16低温离心机 湖南湘仪实验仪器开发有限公司;SW-CT-2FD超净工作台 苏州苏洁净化设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 ASA浸泡处理 参照Bi等[14]方法稍作修改。将苹果果实分别用自来水和0.02%次氯酸钠冲净并晾干,置于2 mmol/L的ASA溶液中浸泡10 min,取出晾干后,放入纸箱,作为处理组,于常温(22±2) ℃、相对湿度55%左右条件下贮藏待用。以自来水处理的果实作对照组。

1.2.2 取样方法 参照Bi等[15]方法并修改。分别在处理后0、2、4、6、8和10 d取健康组织和发病组织交界处果肉皮下3 mm处的果肉组织3.0 g,锡箔纸包好后液氮冷冻,保藏于-80 ℃超低温冰箱中待测。每个处理时间取样用9个果实,重复3次。

1.2.3 病斑直径及自然发病率测定

1.2.3.1 病斑直径 参照葛永红[16]的方法并稍作修改。取ASA处理后常温贮藏2 d的果实,经75%酒精表面消毒后,用直径3 mm灭菌铁钉在果实表面等距离刺孔4个。分别接种30 μLT.roseum孢子悬浮液(1×106个/mL)于孔内。晾干后放入聚乙烯塑料袋中,于室温(22±2) ℃、相对湿度85%条件下贮藏,分别在3、6、9和12 d后测量病斑直径,无菌水处理作为对照。

1.2.3.2 自然发病率 ASA处理和对照组果实放置于20 ℃、相对湿度85%条件下贮藏,定期统计果实自然腐烂情况并计算腐烂率。每个处理组用果实10个,重复3次。

1.2.5 H2O2含量 参照Prochazkova等[18]方法并稍作修改。取3.0 g果肉组织(ASA处理和对照组),加入2 mL冷丙酮,冰浴磨成浆后于4 ℃,9000 r/min条件下离心20 min,取1 mL上清液,加入200 μL浓氨水和200 μL 10%四氯化钛溶液,混匀反应5 min后离心15 min,沉淀部分用冷丙酮洗涤5次后溶于2 mL 1 mmol/L H2SO4溶液,于410 nm测定溶液的吸光度值。H2O2含量以ΔOD410/g FW-1表示。

1.2.6 NADPH氧化酶(NOX)活性 参照Sagi等[19]方法并稍作修改。取300 μL的细胞膜微膜囊依次加入2 mL 100 mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.5),0.5 mmol/L XTT,100 μmol/L NADPH,最后加入NADPH启动酶促反应,以蒸馏水作参照,记录2 min内反应体系在470 nm处吸光度值的变化,NOX活性表示为ΔOD470·min-1·mg-1protien。

1.2.7 超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性 SOD的活性测定:参照Oberley等[20]方法并稍作修改。取5 mL指形管4支,2支为测定管,另2支为对照管,依次加入2 mL 50 mmol/L磷酸缓冲液、0.3 mL 150 mmol/L甲硫氨酸(MET)溶液、0.3 mL 750 μmol/L氮蓝四唑(NBT)溶液、0.3 mL 100 μmol/L EDTA-Na2溶液、0.3 mL粗酶液,0.3 mL 20 μmol/L核黄素。对照管以缓冲液代替酶液,混匀后将1支置于暗处,其它各管于4000 LUX日光灯下反应15 min。至反应结束后,以不照光管做空白参比,于560 nm处分别测定其它各管的吸光度值。SOD活性以U/mg protein表示。

CAT的活性:参照Clairbone等[21]方法并稍作修改。取2 mL 10 mmol/L H202和200 μL粗酶液反应液在240 nm处测吸光度值,连续测定2 min,以每分钟吸光度值变化0.01为1个CAT活力单位(U),以U/mg Protein表示其活性。重复测定3次。

1.2.8 POD活性 参照Liu等[22]方法并稍作修改。取冷冻的果肉组织3.0 g,加入5 mL 4 ℃预冷的100 mmol/L磷酸缓冲液,冰浴下研磨成浆,在4 ℃ 11250 r/min条件下离心20 min,取200 μL上清液加入200 μL 250 mmol/L H2O2和2.5 mL 25 mmol/L愈创木酚,15 s后开始记录反应体系在470 nm处2 min内吸光度值变化,以每分钟吸光度值变化0.01为1个POD活力单位(U),酶活性表示为U/mg protein。重复测定3次。

1.3 数据分析

用SPSS 17.0软件进行差异显著性分析,Microsoft Excel 2010软件计算实验的标准误差并制图。

2 结果与分析

2.1 ASA处理对苹果果实损伤接种T. roseum后病斑直径和发病率的影响

ASA处理组与对照组果实损伤接种T.roseum后,ASA处理能够明显降低(p<0.05)果实的病斑直径。接种后第9和12 d分别较对照组降低17.39%和16.29%(图1A)。同样,ASA处理果实的自然发病率明显低于对照(p<0.05)。在贮藏1周后,对照果实开始发病,贮藏第2、3和4周时,经ASA处理的果实发病率分别为对照组果实的18.75%、31.57%和56.18%(图1B)。

图1 ASA处理对富士苹果损伤接种T. Roseum 后病斑直径(A)和自然发病率(B)的影响Fig.1 Effect of ASA treatment on the lesion diameter(A) and natural disease incidence(B)of apple fruit inoculated with T. Roseum注:图中ASA处理组和对照组相同字母时表示差异不显著(p>0.05),不同字母表示差异显著(p<0.05)。

2.2 ASA处理对富士苹果果实H2O2含量和产生速率影响

图2 ASA处理对富士苹果果实 产生速率(A)和H2O2含量(B)的影响。Fig.2 Effect of ASA treatment on the rate of production(A)and the content of H2O2(B)in apple(Fuji)fruit

2.3 ASA处理对富士苹果果实NADPH氧化酶和SOD活性的影响

采后ASA浸泡处理可以有效提高果实NOX活性(图3A)。贮藏过程中,NOX活性总体呈现先上升后下降趋势。从贮藏第2 d 起,ASA处理果实明显高于对照(p<0.05),处理后第4 d和第6 d,分别较对照组高64.43%和26.68%。同样,ASA处理也明显增强了SOD活性(p<0.05)(图3B),处理后第8 d和第10 d分别较对照组果实高14.2%和24.42%。

图3 ASA处理对富士苹果果实 NOX(A)和SOD(B)活性的影响。Fig.3 Effects of ASA treatment on NOX(A) and SOD(B)activities in apple(Fuji)fruit

2.4 ASA处理对富士苹果果实POD和CAT活性的影响

随贮藏时间延长,处理组与对照组果实POD活性均呈现先上升后下降的趋势,在贮藏第8 d活性达到最大值。ASA处理可提高果实POD的活性,处理后第8 d时,存在显著性差异(p<0.05),处理组较对照高41.58%(图4A)。处理与对照果实的CAT活性均呈现逐渐下降的趋势,但ASA处理抑制了果实CAT活性,处理后第6 d时差异显著(p<0.05),处理组较对照低42.9%(图4B)。

图4 ASA处理对富士苹果果实 POD(A)和CAT(B)活性的影响。Fig.4 Effects of ASA treatment on POD(A) and CAT(B)activities in apple(Fuji)fruit

3 结论与讨论

本研究表明,ASA处理能够有效抑制损伤接种T.Roseum后富士苹果果实果肉部分霉心病发病率和病斑直径的扩展。马凌云等[23]研究发现ASA处理能够抑制采后油桃果实冷藏条件的发病率,在葡萄[24]和芒果[12]上的研究也发现ASA处理能够有效抑制葡萄霜霉病和绿芒果炭疽病的病斑直径。

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