海灵菇酪氨酸酶超声波辅助萃取工艺研究

彭嘉璇，高明会，姜茜茜，陈新峰，钟宝

（吉林农业科技学院食品工程学院，吉林吉林132101）

海灵菇产自远洋深海，因其形似菇，故取名海灵菇。属绿色无污染的软体动物。海灵菇体厚、肉质坚实、光亮平滑，可食用，味道鲜美，营养丰富。

酪氨酸酶（tyrosinase）又名陈干酪酵素、多酚氧化酶、儿茶酚氧化酶等，是一种含铜氧化还原酶，广泛存在于动植物、微生物和哺乳动物中，是儿茶酚胺黑色素合成的关键酶，其加氧和氧化双重功能可增强生物体表面机械强度，并在外来物入侵时获得免疫反应过程中有重要作用[1-3]。酪氨酸酶对底物（羧酸及其衍生物、苯胺及其衍生物、酚类及其衍生物及其他非酚类等）都具有较强的催化降解能力，近年来，酪氨酸酶被广泛用于食品加工、医学、美容、生物传感器、环境保护、染料脱色等方面的研究[4-5]。

海灵菇含有酪氨酸酶，对降低血压有明显效果。中医认为，海灵菇有滋阴养胃、补虚润肤之功能。同时，酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶，可能是白癜风自身免疫的重要抗原。最近发现部分白癜风患者血清中有酪氨酸酶抗体，且与白癜风临床类型和分期密切相关。自身免疫性白癜风发病机制与酪氨酸酶的抗体水平有关，为其免疫治疗提供依据[6-7]。

国内主要利用海灵菇制作菜肴和小吃，关于海灵菇的相关研究未见报道，因此加强对其研究，对获得低成本、来源广泛的酪氨酸酶及其相关性质的研究具有重要的经济和理论意义。本试验以海灵菇为原料，利用超声波时间短、效率高、耗能低的特点进行萃取，以酪氨酸酶的得率为最终的评价指标[8-15]，在超声功率、超声时间、超声温度3个单因素试验的基础上，结合响应面法优化工艺条件，从而得到最佳的酪氨酸酶萃取工艺参数，为后期开发利用海灵菇酪氨酸酶和工业化生产酪氨酸酶提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 试验材料

鲜海灵菇：日照渔贝尔食品有限公司；磷酸钠缓冲溶液（纯度≥99.99%）：鞍山润生物资有限公司；聚乙烯吡咯脘酮（纯度≥99.99%）：北京康普汇维科技有限公司；硫酸铵（分析醇，纯度≥99.99%）：天津试剂厂。

1.1.2 试验仪器

UV-2802S紫外可见分光光度计：上海尤尼柯仪器有限公司；TB-214电子分析天平、PE20K酸度计：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；JYL-Y99料理机：九阳股份有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；BCD-206STA海尔冰箱：海尔集团股份有限公司；DIRECT-Q3超纯水器：美国密理博公司；TGL-16G台式离心机：上海安亭科学仪器厂；SCIENTZ－ⅡD超声波细胞破碎仪：宁波新芝超声设备有限公司；R-215旋转蒸发仪：瑞士步琪公司；SHB-III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司。

1.2 工艺流程及操作要点

1.2.1 工艺流程

原料→预冷冻→缓冲液→打浆→过滤→硫酸铵→超声处理→离心→倾出上清液→硫酸铵→超声处理→离心→沉淀→定容

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 制取海灵菇匀浆滤液

将预先冷藏过的海灵菇，准确称量100 g，加入100 mL预冷磷酸钠缓冲溶液和2 g聚乙烯吡咯脘酮，多次间歇性匀浆。匀浆后，倒出海灵菇混合物，双层纱布过滤，用0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液冲洗纱布，收集滤液，弃残渣物质。

1.2.2.2 超声波萃取

加入研磨细的硫酸铵，使达到10%饱和度，采用超声波进行处理。将滤液分装至50 mL离心管内，3 800 r/min，离心15 min，弃掉上清液；继续加入研磨细的硫酸铵，使达到70%饱和度，采用超声波进行处理。将滤液分装至50 mL离心管内，3 800 r/min，离心20 min，弃掉上清液。取出沉淀定容于250 mL容量瓶，待用。

2 结果与分析

2.1 海灵菇酪氨酸酶超声波辅助萃取单因素试验结果与分析

2.1.1 不同超声功率对酪氨酸酶得率的影响

分别量取15 mL待测溶液于5个量筒中，加入研磨细的硫酸铵，使其达到10%的饱和度。用玻璃棒搅拌均匀，置于超声波细胞破碎仪中，在超声时间为30 min，超声温度为40℃的条件下，分别选取70、80、90、100、110 W的超声波功率，进行提取，测量不同功率条件下所得提取液的酪氨酸酶的得率。结果见图1。

图1 超声波功率对酪氨酸酶得率的影响Fig.1 The effect of ultrasonic power on the rate of tyrosinase

由图1可知，超声功率的变化范围在70 W～110 W内，酪氨酸酶的提取率先增大后减小，在功率为90 W时达到最大值，功率过高，会破坏酪氨酸酶的结构，使其有效的成分融入提取剂中，使得提取率降低。

2.1.2 不同超声时间对酪氨酸酶得率的影响

分别量取15 mL待测溶液于5个量筒中，加入研磨细的硫酸铵，使其达到10%的饱和度，用玻璃棒搅拌均匀，置于超声波发生器中，在超声波功率为90 W，超声温度为40℃的条件下，分别选取10、20、30、40、50 min的超声时间，进行提取，测量不同时间条件下所得提取液的酪氨酸酶的得率。结果见图2。

图2 超声时间对酪氨酸酶得率的影响Fig.2 The effect of ultrasound time on the rate of tyrosinase

由图2可知，在超声功率为90 W，超声温度为40℃的情况下，超声时间变化范围在10 min～50 min内，酪氨酸酶的提取率先增高后保持不变，在超声时间为30 min时达到最大值，时间过短时，酪氨酸酶还没有充分被提取，但由于功率保持不变，所以当达到最适时间后，酪氨酸酶的得率几乎没有变化。

2.1.3 不同超声温度对酪氨酸酶得率的影响

分别量取15 mL待测溶液于5个量筒中，加入研磨细的硫酸铵，使其达到10%的饱和度。用玻璃棒搅拌均匀，置于超声波发生器中，在超声波功率为90 W，超声时间为30 min的条件下，分别选取30、35、40、45、50℃的超声温度，进行提取，测量不同温度条件下所得提取液的酪氨酸酶的得率。结果见图3。

图3 超声温度对酪氨酸酶得率的影响Fig.3 The effect of ultrasound temperature on the rate of tyrosinase

由图3可知，酪氨酸酶的最适温度在40℃左右，所以温度过低时，没能激活酶的活性，当超声处理温度过高时，使酪氨酸酶致死，失去活性，因此酪氨酸酶的得率会下降，只有在40℃左右（最适温度）时，酪氨酸酶的得率最高。

2.2 响应面法优化海灵菇酪氨酸酶工艺条件

2.2.1 响应面试验

根据Box-Behnken设计原理和单因素试验结果，以超声波功率、超声时间、超声温度为因素，以酪氨酸酶提取率为响应值，设计三因素三水平的响应面优化试验，每一组试验设计两个重复，计算其平均值，结果见表1。

表1 响应面分析因素与水平表Table 1 Response surface analysis factor and level table

根据单因素，进行三因素三水平的响应面分析，安排17组处理组合，考察超声功率A，超声时间B，超声温度C，对海灵菇酪氨酸酶得率R1的影响（具体见表2）。

表2 海灵菇酪氨酸酶响应面试验设计与结果Table 2 Tyrosinase response surface test design and results

2.2.2 海灵菇酪氨酸酶回归模型、方差分析及显著性检验

采用Design-Expert8.0.6软件对表2进行多元回归模型拟合、方差分析及显著性检验。得到初步回归方程为：R1=+1.70+0.11A+0.23B+0.27C-0.19AB-0.1AC+0.23BC-0.19A2-0.74B2-0.23C2

对该模型进行显著性检验，可得到方差分析见表3，模型的可信度分析见表4。

由表3、表4可知，模型的P值小于0.000 1，远小于0.01，说明该模型极显著，实际的测定值与回归模型的设计可以最大限度拟合，试验的误差比较小，所以，能够用该回归方程来代替试验的真实值对试验结果进行分析，得到R2=97.85%，预测值与实测值之间存在着较高相关性，也就说明该方程具有比较高的可靠性。该回归模型中，一次项、交互项、二次项中，都表现出了极显著水平或显著水平。方差分析结果还表明，影响酪氨酸酶得率的因素为超声温度C＞超声时间B＞超声功率A。

表3 回归方程ANOVA分析表Table 3 Analysis of variance for fitted quadratic regression equation

表4 回归模型的可信度分析Table 4 Reliability analysis of the established regression model

2.3 各因素交互作用对酪氨酸酶得率的影响面分析

在回归模型方差分析结果的基础上，利用软件做超声功率、超声时间、超声温度影响的等高线和响应面图，结果如图4、图5、图6所示。

图4 超声功率、超声时间对酪氨酸酶得率影响的等高线和响应面Fig.4 Contour and response surface of the effect of ultrasonic power and ultrasonic time

图5 超声功率、超声温度对酪氨酸酶得率影响的等高线和响应面Fig.5 Contour and response surface of the effect of ultrasonic power and ultrasonic temperature on the rate of tyrosinase

图6 超声时间、超声温度对酪氨酸酶得率影响的等高线和响应面Fig.6 Contour and response surface of the effect of ultrasonic time and ultrasonic temperature on the rate of tyrosinase

2.4 酪氨酸酶的率优化工艺参数验证

为进一步确定最佳参数，对拟合的回归方程求分别一阶偏导数，并设其为0，得到三元一次方程如下：

求解得：A=90，B=30，C=40 即最佳组合为：超声功率为90 W，超声时间为30 min，超声温度为40℃。对工艺参数进行3次验证试验，制得酪氨酸酶得率的平均值为1.70%，与理论的预测值比较接近，表明该响应面所得到的数学模型是可靠的模型，具有一定的应用价值。

3 结论

本试验以海灵菇为原料，研究超声波辅助萃取海灵菇酪氨酸酶的工艺，在萃取过程中，对超声功率、超声时间、超声温度等因素进行分析，并通过响应面法进一步优化试验工艺参数，所得的数据表明，超声温度C＞超声时间B＞超声功率A。

在单因素试验的基础上，运用响应面对海灵菇酪氨酸酶的提取条件进行了优化，并建立了回归模型方程，通过验证表明该模型具有一定的合理性和可靠性。最终得到最佳酿制工艺参数为：超声功率90 W，超声时间30 min，超声温度40℃。酪氨酸酶的得率的平均值为1.70%。

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