铜绿假单胞菌的信号分子3-oxo-C12-HSL促进小鼠MH-S肺泡巨噬细胞自噬

鄂顺梅，鲁 洋，曾建明，陈 茶

(广州中医药大学第二附属医院 检验医学部， 广东 广州 510006)

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa, PA)是临床上导致院内感染的重要条件致病菌[1]。PA对抗生素的广泛耐药迫切需要新的治疗方法出现。自噬是宿主清除病原体感染的重要途径，但通常只有细胞内细菌才可引发自噬。研究表明，作为细胞外菌的PA在感染宿主细胞的过程中，可以逃逸到自噬体囊泡中，并通过自噬途径降解[2-3]。PA感染细胞时可见小部分双膜自噬体结构内有PA包裹其中，但是绝大部分自噬体内没有PA，推测并不是PA菌体本身引发的细胞自噬。而3-oxo-C12-HSL作为PA分泌的信号分子，它可以自由进出宿主细胞[4]；同时3-oxo-C12-HSL可以引发人表皮细胞HaCaT细胞自噬[5]，该作用是否具有普遍性，它能否引起其他细胞自噬，尚须进一步研究证实。本研究拟探讨3-oxo-C12-HSL对MH-S小鼠肺泡巨噬细胞自噬的影响。阐明3-O-C12-HSL信号分子对自噬的影响，将提高对宿主防御该病原体的认识，探索新的自噬调控方法可为感染性疾病的治疗和预防提供新的策略或靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠MH-S肺泡巨噬细胞(广州吉妮欧生物科技有限公司，ATCC来源)；细胞培养试剂：胎牛血清、RPMI-1640培养基、青链霉素和PBS磷酸钾缓冲液(Hyclone公司)；Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；野生型PA菌株由美国罗切斯特大学Barbara H. Iglewski教授馈赠，LasⅠ基因缺失的PA菌株由本实验室构建[6]；N-(3-oxododecanoyl)-L-HSL(3-oxo-C12-HSL)、氯喹(chloroquine diphosphate)、LPS和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3MA)(均Sigma公司)；cellTiter 96AQ单溶液细胞增殖检测试剂(Promega公司)；LC3B(D11)XP抗体(CST公司)；p62抗体(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 MH-S细胞培养及药物处理：将MH-S细胞培养于含10%胎牛血清的1640培养基中。细胞过夜培养后，用20 μmol/L氯喹和5 mmol/L 3MA处理5 h。而后经PBS洗涤1次，再用PA(LasⅠ野生型或缺失型)上清液(1∶50稀释)或3-O-C12-HSL(10 μmol/L)处理5 h。

1.2.2 MTS法检测细胞增殖：用MTS细胞增殖试验确定3-oxo-C12-HSL或PA培养物上清液的浓度。具体方法如下：0.25%胰蛋白酶消化细胞后调整细胞浓度，接种到96孔板，每孔100 μL(8×104个细胞/孔)。细胞培养过夜后，经3-oxo-C12-HSL或PA上清液处理0、1、3、5、12和24 h后，收集各个时间点的细胞，加入细胞增殖检测试剂。4 h后在酶标仪上读取A490吸光度。每份样品均做3个复孔，重复2次。

1.2.3 比浊法检测PA的增殖曲线：挑取PA单个菌落接种于3 mL LB培养基中，37 ℃恒温摇床200 r/min培养过夜。取20 μL培养物接种于3 mL LB培养基中，37 ℃振荡培养，每小时检测A600吸光度值，绘制增殖曲线。实验重复3次。3-oxo-C12-HSL信号分子在PA菌株增殖至指数期时浓度达到高峰[6]。将指数期的PA培养物离心，上清液经0.22 μm滤膜过滤除菌，-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.4 激光共聚焦显微镜检测LC3-GFP阳性细胞：首先将5%明胶包被的无菌玻片置于24孔板中，将细胞传代置玻片上，培养过夜。待其细胞间的汇合度为70%～80%时，采用Lipofectamine 2000转染试剂进行转染，每孔加入1 μg pSELECT-GFP-LC3质粒。孵育4 h后换为含血清的细胞培养基。转染36 h后，再用PA上清液或3-O-C12-HSL处理MH-S细胞5 h。在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光斑点(GFP puncta)。每张片至少计数100个细胞，包含5个及以上绿色荧光斑点的才为LC3-GFP阳性细胞。实验重复3次。

1.2.5 Western blot检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值变化和p62表达改变：用1×SDS裂解细胞，超声破碎细胞10～15 s后，95 ℃煮沸变性提取总蛋白。将10 μg总蛋白经10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳结束后转移到PVDF膜上，室温经5%脱脂奶粉封闭2 h，LC3B或p62的抗体(5% BSA溶液1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000稀释)室温孵育45 min，加入ECL化学发光显色液(GE Amersham公司)，暗室内曝光，扫描图片，用凝胶图像处理系统分析目标带的分子量和净吸光度值。实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 3-oxo-C12-HSL对MH-S细胞增殖的影响

MH-S细胞在1∶20和1∶10稀释的野生型PA培养物上清液中12及24 h的细胞增殖低于对照组(P<0.05)(图1)。LasⅠ基因缺失型PA菌株无3-oxo-C12-HSL信号分子分泌[6]，且对MH-S细胞增殖无影响(结果未展示)。

25 μmol/L的3-oxo-C12-HSL处理MH-S细胞12及24 h，细胞的增殖显著低于对照组(P<0.01)，其中50 μmol/L的3-oxo-C12-HSL处理MH-S细胞不同时间，细胞增殖均明显低于对照组(P<0.01，P<0.001)(图2)。

2.2 PA分泌的3-oxo-C12-HSL信号分子对MH-S细胞自噬的影响

在无PA上清液处理的MH-S细胞(对照组)中，LC3-GFP融合蛋白弥散于胞质中，很少形成LC3-GFP荧光斑点；野生型PA培养物上清液处理MH-S细胞后，细胞核周围可见LC3-GFP荧光斑点增多(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with control group图1 不同浓度的野生型PA培养物上清液对MH-S细胞增殖的影响Fig 1 Effect of different concentrations of wild-type PA culture supernatant on the proliferation of

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with control group图2 不同浓度的3-oxo-C12-HSL对MH-S细胞增殖的影响Fig 2 Effect of different concentrations of 3-oxo-C12-HSL on the proliferation of MH-S n=6)

野生型PA上清液处理MH-S细胞5 h后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值较对照组明显增高(P<0.01)，且3MA可以明显抑制胞质型LC3Ⅰ向膜型LC3Ⅱ的转换(P<0.05)。同时可见LasⅠ缺失型PA上清液也使LC3BⅡ/LC3Ⅰ比值轻微增高。1 μg/mL的LPS可明显增强自噬水平(P<0.05)，而100 ng/mL的LPS可诱导轻微自噬发生(图4)。

2.3 化学合成的3-oxo-C12-HSL药物对MH-S细胞自噬的影响

化学合成的10 μmol/L 3-oxo-C12-HSL药物处理MH-S细胞后可见明显的LC3-GFP荧光斑点形成(P<0.01)(图2)。3-oxo-C12-HSL可以明显促进LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转化，3MA能够抑制该转化作用(P<0.05,P<0.01)(图5A)。溶酶体降解抑制剂氯喹可以明显增强3-oxo-C12-HSL引起的LC3Ⅱ的累积(P<0.05)(图5B)。同时p62可随着3-oxo-C12-HSL作用时间的延长而表达逐渐减少(P<0.05,P<0.01)(图5C)。

A.GFP puncta was visualized by confocal laser scanning microscope after treatment of MH-S cells with the PA culture medium or 3-oxo-C12-HSL or LPS for 5 hours； B.Puncta numbers in each cell was determined， the data are representative of 100 cells for each channel;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with control group

图3荧光共聚焦显微镜观察经PA培养物上清液或3-oxo-C12-HSL处理后的GFP-LC3荧光斑点

A.Western blot of LC3 was performed, MH-S cells infected with PA culture medium for 5 hours, before infection, the cells were treated with or without 3MA (5 mmol/L, 5 hours); B.semiquantitative analysis;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;#P<0.05 compared with wt-PA group

图4Westernblot检测PA培养物上清液处理5h后LC3BⅡ/LC3Ⅰ比值变化

3 讨论

90%以上的慢性囊性纤维化(cystic fibrosis，CF)感染均由PA所引起，且一旦感染很难根治。CF患者慢性感染的机制之一是自噬通路受损，病原体不能通过自噬途径清除，导致慢性反复性感染的发生[7-8]。调控自噬可有效地清除PA引发的感染。肺泡巨噬细胞在宿主防御系统中发挥重要作用，是公认的呼吸道免疫系统的前哨细胞，也是入侵病原体的第一个响应者[9]。最近发现自噬调节了PA从肺泡巨噬细胞和肥大细胞的清除，体内实验也可观察到同样的现象[2-3]，但PA引发自噬的成分尚不明确。本研究以MH-S肺泡巨噬细胞为研究对象，探讨PA信号分子3-oxo-C12-HSL能否引发MH-S细胞自噬。

本实验首先采用PA培养物上清液感染小鼠MH-S细胞，LasⅠ基因缺失导致PA不能分泌3-oxo-C12-HSL信号分子，从而使得LasⅠ基因缺失型PA培养物上清液引发的自噬率较野生型明显下降。LasⅠ基因缺失的PA引起自噬率轻微增加， 可能是其释放的少量LPS所引起，具体机制尚需进一步证实。化学合成的3-oxo-C12-HSL信号分子能够明显增加自噬体数量，上调LC3Ⅱ的表达。氯喹和3-oxo-C12-HSL同时作用MH-S细胞后，LC3BⅡ/LC3BⅠ比值可较3-oxo-C12-HSL单独作用明显提高，这就排除了自噬体和溶酶体融合受阻引发的自噬增强；同时自噬底物p62随着3-oxo-C12-HSL作用时间的延长而逐渐降解，而细胞内p62的含量同自噬的活性呈负相关。以上结果均提示3-oxo-C12-HSL可以引发MH-S细胞自噬。3-oxo-C12-HSL引发细胞自噬的机制尚需进一步研究探讨。

A.Western blot of LC3 was performed, MH-S cells treated with treated with 3MA (5 mmol/L, 5 hours), and then treated with 3-oxo-C12-HSL (10 μmol/L) for 5 hours; B.Western blot of LC3 was performed, MH-S cells were treated with chloroquine (CQ, 20 μmol/L, 5 hours) and then treated with 3-oxo-C12-HSL (10 μmol/L) for 5 hours; C.Western blot of p62 was performed, MH-S cells were treated with 3-oxo-C12-HSL (10 μmol/L) for the indicated times;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group；#P<0.05 compared with 3-oxo-C12-HSL group

图5铜绿假单胞菌的信号分子3-oxo-C12-HSL增强自噬降解

自噬在固有免疫和适应性免疫中与病原体相互作用中发挥着广泛而重要的作用[10-12]。PA感染时能够引发有效的免疫应答，必须要求宿主细胞内具备完善的自噬机制。自噬在控制PA感染方面发挥重要作用，一旦自噬受阻，细菌不能清除，通常会导致感染迁延不愈，最终抗生素长期应用又导致了细菌多药耐药现象的发生。本研究发现PA的信号分子3-oxo-C12-HSL可以诱导MH-S肺泡巨噬细胞自噬。通过深入探讨3-oxo-C12-HSL引发自噬的功能和机制，将为自噬相关疾病特别是感染性疾病的防治提供新的机会和途径。以3-oxo-C12-HSL引发自噬途径为靶点的药理学干预在治疗铜绿假单胞菌肺部感染方面具有相当大的治疗潜力。

：

[1] Vidya P, Smith L, Beaudoin T,etal. Chronic infection phenotypes ofPseudomonasaeruginosaare associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis [J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2016, 35: 67-74.

[2] Yuan K, Huang C, Fox J,etal. Autophagy plays an essential role in the clearance ofPseudomonasaeruginosaby alveolar macrophages [J]. J Cell Sci, 2012, 125: 507-515.

[3] Junkins RD, Shen A, Rosen K,etal. Autophagy enhances bacterial clearance duringP.aeruginosalung infection [J]. PLoS One, 2013, 8: e72263. doi: 10.1371/journal.pone.0072263.

[4] Kariminik A, Baseri-Salehi M, Kheirkhah B.Pseudo-monasaeruginosaquorum sensing modulates immune responses: An updated review article [J]. Immunol Lett, 2017, 190: 1-6.

[5] von Hoven G, Kloft N, Neukirch C,etal. Modulation of translation and induction of autophagy by bacterial exoproducts[J]. Med Microbiol Immunol, 2012, 201: 409-418.

[6] Zeng J, Zhang N, Huang B,etal. Mechanism of azithromycin inhibition of HSL synthesis inPseudomonasaeruginosa[J]. Sci Rep, 2016, 6: 24299. doi: 10.1038/srep24299.

[7] Reilly R, Mroz MS, Dempsey E,etal. Targeting the PI3K/Akt/mTOR signalling pathway in cystic fibrosis[J]. Sci Rep, 2017, 7: 7642. doi: 10.1038/s41598-017-06588-z.

[8] Brockman SM, Bodas M, Silverberg D,etal. Dendrimer-based selective autophagy-induction rescues ΔF508-CFTR and inhibitsPseudomonasaeruginosainfection in cystic fibrosis[J]. PLoS One, 2017, 12: e0184793. doi: 10.1371/journal.pone.0184793.

[9] Kopf M, Schneider C, Nobs SP. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells [J]. Nat Immunol, 2015, 16: 36-44.

[10] Cadwell K. Crosstalk between autophagy and inflammatory signalling pathways: balancing defence and homeostasis [J]. Nat Rev Immunol, 2016, 16: 661-675.

[11] Weindel CG, Richey LJ, Mehta AJ,etal. Autophagy in dendritic cells and B cells is critical for the inflammatory state of TLR7-mediated autoimmunity [J]. J Immunol, 2017, 198: 1081-1092.

[12] Kimmey JM, Stallings CL. Bacterial pathogens versus autophagy: implications for therapeutic interventions [J]. Trends Mol Med, 2016, 22: 1060-1076.