当归补血汤对糖尿病肾病大鼠PERK通路的影响*

沈 鑫，张思泉，张莹雯，柯浩亮，帅 瑜

（武汉大学附属中南医院，武汉 430071）

糖尿病肾病（DN）是糖尿病的一种严重并发症，是导致终末肾衰竭（ESRD）的主要原因之一[1]。近30年来，随着世界范围内糖尿病患者的增加，DN发病率也随之急剧提高[2]。DN发病机制复杂，涉及多种细胞因子和信号转导通路，包括糖代谢紊乱、氧化应激、血流动力学异常、细胞因子参与以及遗传因素等[3]。内质网应激（ERS）是近年来新发现的DN发病机制，被证实与DN关系密切[4-6]。本实验旨在探讨当归补血汤对DN大鼠GRP78-PERK-eIF2α通路的影响，为当归补血汤治疗DN提供新依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠60只，6～8周龄，体质量180～210 g，均购自武汉大学实验动物中心[许可证号:SCXK（鄂）2014-0004]。饲养于武汉大学实验动物中心标准饲养房，室温（22±2）℃，相对湿度60%，每日光照12 h，实验期间不限饮食和饮水，定期更换敷料，连续观察8周。

1.1.2 实验药物 当归补血汤由当归、黄芪按1∶1配比（前期实验提示此为治疗DN最优配比），药物饮片购自湖北省中药材公司，当归、黄芪生药饮片浸水1 h，煮沸40 min，过滤后的药渣再次加水煮沸，重复2次，合并煎煮液，在水浴中浓缩，置4℃冰箱备用，按实验需要再行旋转蒸发浓缩备用。

1.1.3 主要仪器和试剂 超净工作台（苏净安泰），全自动生化分析仪（日本东芝公司），倒置光显微镜（Olympus日本），透射电子显微镜（日立公司），超薄切片机（瑞典Bromma公司），台式离心机（上海安亭科学仪器厂），PCR仪（杭州博日科技），电泳仪（北京市六一仪器厂），链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司，溶于 0.1 mol/L，pH＝4.3 的柠檬酸钠缓冲液中）；RIPA总蛋白裂解液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、BCA蛋白质浓度测定试剂盒、ECL化学发光检测试剂盒（ASPEN）等。

1.2 方法

1.2.1 饲养条件 实验动物饲养于武汉大学实验动物中心标准饲养房，普通饲料和高脂饲料均由实验动物中心提供。室温20℃，相对湿度60%，每日光照12 h，实验前先适应性饲养1周，实验期间不限饮食和饮水，定期更换敷料，连续观察8周。

1.2.2 糖尿病大鼠的分组和造模 大鼠适应性饲养1周后，随机选取10只为对照组（n＝10），喂普通饲料;其余大鼠为造模组（n＝50）喂以高脂饲料，大鼠均不限饮食和饮水。1周后，将造模组大鼠禁食12h，并给予一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg（溶于0.1 mmol/L，pH＝4.3的柠檬酸钠缓冲液中），对照组给予相同剂量的柠檬酸钠缓冲液（0.1 mmol/L，pH＝4.3）一次性腹腔注射，注射48 h后采足底静脉血，连续3 d测随机血糖，血糖≥16.7 μmol/L 视为糖尿病大鼠造模成功[7]。造模组成活且造模成功的大鼠共43只，随机选取40只纳入实验，随机分为模型组[n＝10，生理盐水10 mL/（kg·d）]，当归补血汤高剂量组[高剂量组，n＝10，7.14 g/（kg·d）当归补血汤溶缩液]，当归补血汤低剂量组[低剂量组，n＝10，1.79 g/（kg·d）当归补血汤溶缩液]，格列齐特组[n＝10，2.68 mg/（kg·d）格列齐特缓释片]，以上药物均通过灌胃方式给药，对照组（N组）给予生理盐水10 mL/（kg·d）灌胃给药，连续灌胃8周后取材。

1.2.3 一般情况及生化指标的检测 观察大鼠的精神、毛色、活动是否灵活、食量、饮水量、尿量等；实验第8周末，用代谢笼收集24 h尿液，记录尿量并于-80℃冰箱保存；所有大鼠禁食12 h，禁水8 h后，称量大鼠体质量，无菌条件下腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉大鼠，腹主动脉采血，离心后取血清，全自动生化分析仪测大鼠空腹血糖（GLU）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）；无菌条件下摘取双肾。

1.2.4 光镜及电镜下观察肾组织 取小鼠肾组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，将组织切片按常规方法进行过碘酸雪夫氏染色（PAS）染色，于光镜200倍视野下观察肾脏组织结构变化。另取肾皮质剪碎用1.25%戊二醛固定，用透射电镜观察肾脏超微结构。

1.2.5 免疫组化检测GRP78、PERK、eIF2α蛋白的表达 取小鼠肾组织于4%多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋，将石蜡切片脱蜡至水后用EDTA缓冲液中微波修复，置于3%过氧化氢溶液中孵育，甩干后以5%BSA封闭，依次加入稀释的一抗、相应种属的二抗于保湿盒中孵育，滴加配制DAB，显微镜控制显色，中性树胶封固后用显微镜观察拍照。

1.2.6 PCR检测大鼠肾组织中GRP78 mRNA、PERK mRNA、eIF2α mRNA的表达 大鼠 GRP78、PERK、eIF2α 引 物 由 Invitrogen Biotechnology Co.,LTD.中国公司合成；总RNA的提取按试剂盒说明操作，用紫外分光光度计测量OD值并计算RNA浓度和质量；根据RNA的量，建立一个20 μL的反应体系，在RT-PCR仪器中进行逆转录反应:42℃30 min，80℃ 5 min，4℃冷却，-20℃保存，在 PCR仪上扩增；目的基因扩增用ΔΔCT法计算，A＝CT（目的基因，实验样本）-CT(内标基因，实验样本)，B＝CT（目的基因，对照样本）-CT（内标基因，对照样本），K＝A-B，表达倍数＝2-K，采用 β-actin为内参，计算GRP78、PERK、eIF2α 的 CT值。

1.2.7 Western blot法检测 GRP78、PERK、eIF2α 蛋白的表达 每组随机选取两只大鼠的肾组织进行蛋白提取，检测蛋白浓度，保证每个样品总蛋白量。每个样品总蛋白上样量均为40 μg，进行制胶与上样，按浓缩胶80 V、分离胶120 V进行恒压电泳，按300 mA恒流转膜，转膜时间根据目的蛋白分子量大小调整，将转好的膜加入封闭液室温封闭1 h，加入已稀释好的一抗4℃过夜（兔属GAPDH，GRP78与5%脱脂牛奶呈 1∶2 000，PERK 与 5%BSA 呈 1∶1 000，eIF2α 与 5%BSA 呈 1∶2 000）用 TBST 洗 3次，每次5 min，加入稀释好的二抗（HRP-Goat anti Rabbit与5%脱脂牛奶呈 1∶10 000），室温孵育 30 min，用TBST在室温摇床上洗4次，每次5 min，暗室中曝光，将胶片进行扫描存档，AlphaEaseFC 4.0软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.2.8 统计学方法 采用SPSS 20.0统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 对照组大鼠体毛光泽，活动敏捷，饮食量、尿量无明显变化，实验第8周末，体质量均较前增加；大鼠造模成功率为86%（43/50），造模成功后的大鼠体质量较对照组明显减轻，每日饮水量及尿量均多于对照组；造模后第4天可见大鼠皮毛湿黄，活动迟缓，多饮、多食、多尿、体质量下降，至实验第8周末，模型组大鼠上述症状最明显，治疗组上述情况得到不同程度改善，以高剂量组改善最为明显。

2.2 生化指标的检测 与对照组相比，模型组大鼠血糖（GLU）、血脂（TG、TC）、尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）及蛋白尿（MAU）均明显升高（P＜0.01）；与模型组相比，各治疗组的 GLU、TG、TC、BUN、Scr及 MAU均下降（P＜0.01 或 P＜0.05），3 个治疗组中，格列齐特组的GLU下降最显著（P＜0.01），高剂量组BUN、Scr、MAU下降最明显（P＜0.01），肾功能改善明显。见表 1、表 2。

表1 各组大鼠GLU、血脂的检测（±s）mmol/L

表1 各组大鼠GLU、血脂的检测（±s）mmol/L

注:与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与格列齐特组比较，△△P＜0.01。

组别 n GLU TG TC对照组 10 5.07±0.61 1.13±0.10 0.83±0.10模型组 10 27.41±0.96## 4.14±0.12## 2.14±0.10##格列齐特组 10 9.92±0.52##** 2.26±0.11##** 1.27±0.10##**低剂量组 10 15.71±0.60##**△△ 3.91±0.18##**△△ 2.05±0.07##*△△高剂量组 10 11.72±0.69##**△△ 2.40±0.15##** 1.35±0.08##**

表2 各组大鼠BUN、Scr及MAU的检测（±s）

表2 各组大鼠BUN、Scr及MAU的检测（±s）

注:与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与格列齐特组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别nBUN（mmol/L）Scr（μmol/L）MAU（mg/L）对照组 10 11.48±0.60 5.12±0.60 0.76±0.05模型组 10 27.81±0.49## 13.98±0.77## 1.50±0.03##格列齐特组 10 18.77±0.45##** 6.41±0.64##** 1.31±0.03##**低剂量组 10 19.45±0.78##**△ 8.27±0.57##**△△ 1.26±0.03##**△高剂量组 10 16.09±0.62##**△△ 5.56±0.48#**△△ 1.02±0.04##**△△

2.3 光镜及电镜下肾脏形态结构观察

2.3.1 光镜下肾脏形态结构 对照组大鼠肾组织结构完整。模型组大鼠肾组织严重损伤，可见系膜细胞增生、基质增多，肾小球基底膜（GBM）增厚，PAS染色呈强阳性，部分肾小球可见毛细血管间出现PAS染色阳性的层状结节及节段性透明样变性，提示肾小球硬化，肾小管上皮肿胀，肾小管管腔变窄。格列齐特组和低剂量组可见轻度弥漫性系膜区细胞增生伴GBM增厚，肾小管无明显改变。高剂量组肾结构改善明显，仅见肾小球轻度水肿，无增生性病变，肾小管无明显改变。见图1。

2.3.2 电镜下肾脏形态结构 对照组GBM厚度基本均匀适中，足细胞位于GBM外层，足突结构完整，呈栅栏状整齐排列。模型组GBM增厚，足细胞出现空泡改变，裂隙膜减少，足突融合，部分足细胞从GBM脱落，排列紊乱；肾小管上皮细胞肿胀变性，可见内质网、线粒体和细胞核肿胀。格列齐特组和低剂量组病变减轻，GBM轻度增厚，系膜基质轻度增多。高剂量组病变改善明显。见图2。

2.4 各组 GRP78、PERK、eIF2α的免疫组化结果 GRP78、PERK、eIF2α在对照组中有少量表达，表现为棕黄色颗粒，三者主要定位在肾小管上皮细胞胞浆内;模型组的 GRP78、PERK、eIF2α 表达较对照组明显增多，差异具有统计学意义（P＜0.01），三者主要定位于肾小管；高剂量组、低剂量组与格列齐特组的GRP78、PERK、eIF2α表达均明显低于模型组（P＜0.01），高剂量组相比于格列齐特组表达更低（P＜0.01 或 P＜0.05）。见表 3 及图 3-5。

表3 各组GRP78、PERK、eIF2α的蛋白表达情况（±s）

表3 各组GRP78、PERK、eIF2α的蛋白表达情况（±s）

注:与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01;与格列齐特组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别 n GRP78 PERK eIF2α对照组 10 3 989.66± 259.44 1 834.63± 116.73 1 683.58± 78.94模型组 10 19 703.39±1 524.04## 12 787.18±1 883.59## 20 566.95±1 944.09##格列齐特组 10 7 238.58± 487.35##** 5 793.39± 401.51##** 5 605.04± 465.45##**低剂量组 10 10 820.29±1 105.42##**△△ 7 738.69± 634.03##**△ 11 707.93±1 340.87##**△△高剂量组 10 5 284.77± 313.01**△ 3 383.93± 249.95**△ 2 250.02± 58.41**△△

2.5 各组GRP78、PERK、eIF2α的mRNA表达情况GRP78、PERK、eIF2α在正常肾组织中有一定量的表达，相比于对照组，模型组大鼠GRP78、PERK、eIF2α 的表达显著增高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。相比于模型组，3个治疗组的 GRP78、PERK、eIF2α的表达均降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。相比于格列齐特组，高剂量组的GRP78、PERK、eIF2α的表达更低（P＜0.01 或 P＜0.05）。见表 4。

2.6 Western blot测 GRP78、PERK、eIF2α 的蛋白表达 相比于对照组，模型组大鼠GRP78、PERK、eIF2α的蛋白表达显著增高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；相比于模型组，各治疗组的GRP78、PERK、eIF2α的表达均降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；相比于格列齐特组，高剂量组的GRP78、PERK、eIF2α的表达更低（P＜0.01 或 P＜0.05），见表 5 及图 6。

3 讨论

图1 各组大鼠肾组织PAS染色结果（×200）

图2 各组大鼠肾组织电镜下观察结果(×2 000)

图3 免疫组化检测GRP78蛋白表达结果(×200)

图4 免疫组化检测PERK蛋白表达结果(×200)

DN在中医学归为消渴病下消，基本病机为“气血两虚兼血瘀”。当归补血汤中黄芪味甘温，可益气固表，补气升阳；当归味甘辛温，可补血生血行血，两者配伍则阳生阴长，气旺血生，具有补气活血之功效，与其病机契合。现代研究发现，黄芪甲苷（IV）可通过下调PERK-ATF4-CHOP通路发挥抑制足细胞凋亡，保护肾组织，防治DN的作用[8]。且当归与黄芪配伍，当归可增强黄芪中黄芪甲苷在体内的活力，并可使黄芪甲苷达峰时间提前1倍[tmax由（4.00±1.54）h 至（2.00±0.95）h]，达峰浓度提高 1 倍[Cmax由（60±7）μg/L 到（146±27）μg/L]，加速黄芪甲苷发挥功效的进程[9]。当归补血汤可抑制高糖条件下肾小球细胞膜外基质蛋白表达[10]，下调多个靶器官相关蛋白因子（BMP-7、TGF、HPA 等），具有预防和治疗早期DN的作用[11-13]。

图5 免疫组化检测eIF2α蛋白表达结果(×200)

表 4 各组 GRP78、PERK、eIF2α 的 mRNA 表达（±s）

表 4 各组 GRP78、PERK、eIF2α 的 mRNA 表达（±s）

注:与对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与格列齐特组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别 n GRP78 PERK eIF2α对照组 10 0.96±0.05 0.97±0.09 0.97±0.10模型组 10 4.50±0.13## 3.11±0.08## 3.02±0.24##格列齐特组 10 1.82±0.12##** 1.80±0.10##** 1.72±0.04##**低剂量组 10 3.05±0.08##**△△ 2.32±0.10##**△△ 2.39±0.07##**△△高剂量组 10 1.49±0.04##**△△ 1.48±0.04##**△△ 1.40±0.04##**△

表 5 各组 GRP78、PERK、eIF2α 的蛋白表达（±s）

表 5 各组 GRP78、PERK、eIF2α 的蛋白表达（±s）

注:与对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01；与格列齐特组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别 n GRP78 PERK eIF2α对照组 10 0.07±0.01 0.04±0.02 0.04±0.01模型组 10 0.84±0.10## 0.47±0.05## 0.66±0.07##格列齐特组 10 0.32±0.05##** 0.20±0.03##** 0.26±0.03##**低剂量组 10 0.51±0.02##**△△ 0.32±0.06##**△△ 0.38±0.01##**△△高剂量组 10 0.18±0.02#**△△ 0.12±0.03#**△ 0.12±0.01#**△△

图6 Western-blot电泳条带图

本实验中，当归补血汤和格列齐特均可改善DN大鼠的一般情况，降低血糖、血脂，而且在降低尿蛋白，改善肾功能和肾脏结构损害方面，当归补血汤优于格列齐特。免疫组化、Western Blot及PCR显示模型组大鼠GRP78、PERK、eIF2α的表达明显高于对照组，表明ERS已经激活；当归补血汤治疗组大鼠肾组织中GRP78、PERK、eIF2α的表达相比于模型组明显下降，高剂量组下降更明显。实验表明当归补血汤可抑制PERK通路相关蛋白，缓解ERS，具有保护肾组织结构和肾功能作用，且呈浓度依赖性。

实验结果为临床治疗DN提供了新的依据。但仍存在问题需进一步探究，当归补血汤具体作用于PERK通路的机制尚不明确，推测当归补血汤可通过抑制PERK通路进一步抑制eIF2α下游的ATF4、CHOP、Capase12等凋亡相关基因缓解ERS造成的损害，是否激活了下游其他分子通路，还需更深入的研究。

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