转录组测序在牧草抗逆基因挖掘方面的应用前景

朱 昊 ，张 博 ，张荟荟 ，王玉祥 ，柯 梅 ，李学森 *

（1.新疆农业大学草业与环境科学学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院草业研究所，乌鲁木齐 830011）

我国的牧草种质资源极为丰富，目前的研究主要集中在以全球变化与农业多样性、农业系统固碳减排、草地农业决策系统及林草生态等宏观方面[1]；同时以分子生物学为基础的微观方面也有许多研究，主要包括DNA水平上的遗传多样性和分子标记辅助选择育种等方面[2-3]。利用新一代高通量测序技术进行牧草种质资源创新及抗逆基因挖掘方面的研究相对较少[4]。

1 RNA-seq技术原理

RNA-seq即转录组测序技术。克里克（Francis Harry Compton Crick,1916-2004）于1958年提出“中心法则”，并于1970年在Nature上的一篇文章中进行了重申。中心法则指出遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。依据中心法则，随着二代测序技术的兴起和成熟，转录组学研究得到了蓬勃发展。简而言之，转录组学（transcriptomics）就是从RNA水平研究基因表达的情况，是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科。

转录组（transcriptome）广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括mRNA、rRNA、tRNA及Non-coding RNA；狭义上指所有mRNA的集合。 RNA-seq，就是把mRNA、small RNA及Noncoding RNA等或者其中一些用高通量测序技术把它们的序列测出来。反映出它们的表达水平。不管物种有无基因序列信息，该技术都能够全面检测其所有基因的表达，具有通量高、成本低、定量准、灵敏度高、重复性好以及检测范围广等特点。

2 RNA-seq一般流程

转录组测序分析技术的流程如下（图1）。

图1 转录组测序及后续生物信息学分析流程图

转录组测序需要注意的事项：（1）取样，每个处理至少得有3个生物学重复，这个对于无参考基因组序列更为重要；（2）RNA的抽提检测，理想的RNA样品是试验取得成功的一切的前提；（3）测序得到Uigene序列后的生物信息学分析是关键，结合试验设计的目的对数据进行深度挖掘。

3 植物应答环境胁迫方面的RNA-seq研究

植物对逆境胁迫的应答是通过细胞分子水平修饰、自身的生理生化改变来顺应不利的生存环境。基因表达具有时空性，抗逆基因的表达尤其明显。对植物的不同组织器官、不同生长发育阶段、不同环境胁迫因子响应时的差异表达的基因进行分析筛选，挖掘关键基因和抗性之间的关联关系，将有助于从转录水平上了解胁迫因子的伤害机理及植物适应逆境胁迫的分子机制。

3.1 温度胁迫

温度是植物生长发育过程中十分重要的环境影响因子。温度胁迫引起植物生理上的变化主要体现在光合作用、细胞膜结构、渗透调节物质、抗氧化物质等方面。吴月燕等［5］以杜鹃为研究材料，人工模拟低温胁迫，进行转录组测序以探索杜鹃抗寒的分子机制。从头测序组装得到Unigenes序列122 654个，有大量的Unigenes注释到同源数据库中，部分Unigenes未得到数据库的注释信息，这可能是杜鹃的特有的基因序列。其转录组数据分析结果表明，差异表达的基因共有10 829个，这些差异基因为揭示杜鹃抗寒机理，提供了大量可靠的转录组水平的基本研究数据，还有待后续研究的进一步挖掘分析。颜朗等［6］通过比较转录组学分析，初步揭示了低温处理下皇竹草的抗寒分子机制。筛选出冬夏两季皇竹草差异表达基因11 443个，挖掘到在冬季低温条件下高度表达的耐寒基因112个，且17个耐寒基因在冬季低温材料中特意表达。韩超等［7］研究了梭梭对高温胁迫的转录组响应情况，分析了差异表达基因的功能和蛋白代谢通路，结果表明，梭梭的同化枝在应答高温单一环境因子胁迫时，多个基因、多个生物过程协同调控。因此，温度这个单一的环境因子变化引起梭梭启动多基因表达系统来应答。

3.2 干旱胁迫

水是生命之源。在干旱胁迫下，植物体通过改变自身组织器官的生理生化状态来适应不利的生存环境[8]。植物对干旱胁迫响应的分子机制通常是通过信号转导、以不同代谢通路上的基因转录和翻译来调控应答。周炎等[9]分析了烤烟品系LY1360在干旱胁迫下的转录组，通过GO和KEGG分析比较干旱胁迫下供试材料的基因和代谢通路差异，结果表明激素信号转导途径的关键基因在干旱胁迫下表达量均显著上调。张春荣等[10]对干旱胁迫下的甘草根进行转录组测序，发现适度干旱促进抗逆相关基因的表达和甘草根有效成分积累。GO富集分析显示天冬酰胺酰内肽酶、β-木糖苷酶、GDP-L-岩藻糖合酶基因下调并显著富集，这表明干旱胁迫可能抑制干草根初生壁的降解与程序性细胞死亡。孙爱清等［11］对花生干旱处理前后转录表达谱变化进行了分析比较，筛选出935个差异表达基因，其中323个基因涉及次生代谢、大分子代谢、能量代谢等代谢途径。在干旱胁迫条件下参与类黄酮代谢途径的9个基因的表达量均显著上调，推断花生在干旱胁迫下类黄酮对抵御干旱起到十分重要的作用。

3.3 盐胁迫

盐胁迫对植物生长的威胁是干旱之外的第二大环境因子胁迫。有关农作物及盐生植物对盐胁迫的转录组研究相对比较深入，现已鉴定出部分相关耐盐基因，涉及到多个代谢途径。吉福桑等［12］研究了巴西蕉叶片在中性单盐NaCl胁迫下的转录组情况，结果表明胁迫12 h差异基因的上调和下调表达数均高于胁迫24 h。KEGG分析表明差异基因主要涉及类酮类和丙酮素生物合成途径以及光合作用等代谢通径。qRT-PCR验证了转录组测序结果可靠可信，为香蕉耐盐机理分析提供了科学参考依据。彭振等［13］以耐盐和敏盐的陆地棉为研究材料，分别研究2个材料在NaCl盐胁迫下幼苗叶片的转录因子的表达情况。通过差异基因筛选，鉴定出26个与耐盐相关的转录因子家族，高表达的11个转录因子基因与陆地棉的耐盐密切相关。张丽丽［14］以荒漠盐碱地常见的盐生植物盐穗木为研究材料，分别对在低盐和高盐下胁迫3 h的同化枝进行了转录组测序。筛选出高盐和低盐胁迫下共差异基因1 254个，有关渗透调节和活性氧清除的基因大多表现为上调基因，说明盐穗木在短期盐胁迫下以增强渗透调节和活性氧清除为应答策略。

4 RNA-seq在牧草抗逆基因挖掘中的研究现状

张纯（2017）[15]梳理了许多植物在逆境胁迫下的转录组应答的研究报告，发现主要集中在水稻、棉花、玉米、大豆、马铃薯、丹参、黄瓜、牡丹等这些作物和药用植物及花卉植物方面；有关牧草植物的研究相对少，仅见星星草、高羊茅及紫羊茅等物种。郭云（2016）[16]基于RNA-seq技术研究了苜蓿根蘖性状发生的下调基因情况。齐晓（2017）[17]对低温胁迫下苜蓿转录因子的鉴定和表达进行了分析。Zhipeng Liu（2013）[18]在国外报到了同源四倍体紫花苜蓿“金皇后”从种子萌发到开花生长发育的阶段的转录组表达情况，基于此转录组数据开发了紫花苜蓿的EST-SSR分子标记引物。此外，冷暖（2017）[19]研究报到了草地早熟禾在干旱胁迫下的转录组应答。通过查阅文献可知，目前国内有关牧草的转录组学研究相对滞后，即使作为牧草之王的紫花苜蓿在转录组方面的研究也很少。

5 展 望

牧草种质资源的挖掘大多集中于优良抗性种质筛选方面，相对作物来讲，有关基因资源分子水平的研究起步晚、研究相对比较浅，有关抗性基因的分析很少。随着二代测序成本的进一步下降及三代测序的兴起，通过RNA-seq技术在牧草优良种质资源基因挖掘方面的应用前景十分广阔。

此外，转录组学可以结合代谢组学和蛋白组学一起来研究，多组学的关联可为牧草种质资源挖掘和优良基因克隆及抗逆机制等方面提供分子水平研究的大数据平台。

参考文献

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