蓝花龙胆HPLC指纹图谱分析及藏药道地药材标准建立必要性探讨

马超白玛央宗尼珍李建川王立辉

（1.西藏自治区高原生物研究所；2.西藏自治区生物工程技术中心，西藏 拉萨 850000）

道地药材是一个中医药概念，是特定产地的在临床长期实践中被大家公认的优质、疗效好的中药材［1-2］。民族医药与中医药都是以药材为基础的传统医学，新中国成立后，民族医药包括蒙医药、藏医药、维吾尔医药等民族医药都取得了一定的发展，但都受其地域、群众基础、典籍、历史、传承特点等因素，发展相对滞后。［3-4］药材是民族医药的载体，相对于中医药地道药材，藏医药中缺少明确道地药材的概念，却存在类似的表述，藏医名著《晶珠本草》中存在一药多图和药材等级的说明，可作为道地药材的筛选的依据［5］。中药道地药材也存在多药多道地的情况［1］，藏医药实际应用中存在一药多源的情况，不同产地及品种的药材品质缺少有效评价［12］，是否都是优质的道地药材需要论证，藏医用药在典籍、文献为基础上，结合传统用药习惯，遴选优质药材，提升藏医药品质［6］。

蓝花龙胆藏文音译“榜间恩保”，在藏药中是龙胆科七叶龙胆G.arethrusae Burk.var.delicatula Marq.、阿墩子龙胆G.atutsiensis W.W.Smith、线叶龙胆G.farreri Balf.f.、道孚龙胆G.altorum H.Smith、丝柱龙胆G.filishtyla Balf.f.等药材的一类开蓝色花的龙胆统称［7-8］。藏药用药考究，传统上蓝花龙胆在藏药中多用花而不包括其他部分，现行藏药标准花或全草用药。蓝花龙胆花的成本高于全草，而实际应用多采用全草入药，花与全草之间可能存在品质差异，同时蓝花龙胆是一类药材，不同种药材之间存在品质差异。［7-10］药材质量是藏药品质的保障，中草药龙胆主要以裂环烯醚萜类化合物龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、当药苷等为指标成分，［11］龙胆苦苷为龙胆科植物指纹图谱的特征峰，研究多采用以龙胆苦苷定量评价并建立指纹图谱。［12-14］文章通过高效液相色谱HPLC对不同来源的蓝花龙胆药材以及同一药材花及茎部马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷进行外标法定量分析和指纹图谱分析，评价了药材本身的质量，为蓝花龙胆的科学应用提供借鉴，也为该藏药标准化与实际藏药生产提供参考，探讨民族医药建立道地药材标准必要性。

1 仪器与材料

1.1 仪器

安捷仑1200系列（G1315D DAD检测器，G1311A Quat泵，G1329A ALS自动进样器，Poroshell 120 ECC18 4μm 4.6×150mm色谱柱)，超声清洗器KQ3200B（昆山市超声仪器有限公司）电子天平JA5003（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），超纯水仪器（Milli-Q,美国）、氮吹仪（Organomation美国）,中药粉碎机,移液器等。

1.2 试剂

甲醇色谱纯(Fisher Scientific)，88%甲酸分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。龙胆苦苷≥98%（北京中科质检生物技术有限公司）批号：160403，獐牙菜苦苷≥98%（中国食品药品检定研究所）批号：must-12070203，马钱苷酸≥98%（北京中科质检生物技术有限公司）批号：160510。

1.3 药材来源及处理

7个来源不同的蓝花龙胆样品（表1）,去除杂质后将部分带花全草在花萼下部剪开分成花及茎两部分，所有样品置于变色硅胶干燥皿中备用。

表1 蓝花龙胆信息表

2 方法与结果

2.1 样品鉴定结果

参照中国植物志［15］鉴定7不同来源样品，样品由西藏自治区高原生物研究所土艳丽研究员鉴定检查，校订。

2.2 色谱条件

流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序：0 min(12%B)、10 min(12%B)、25 min(30%B)、40 min(55%B)、50min(100%B)样品分析 85min 检测波长240nm；柱温30℃；体积流量1.0 ml/min；进样量5μL。所有组分分析85min。

2.3 三种物质线性考察

以马钱苷酸在19.125-91.8ug/L、獐牙菜苦苷在21.5-688ug/L龙胆苦苷32-1024ug/L范围进行线性考察，每个梯度（n=7）进样3次，考察不同梯度RSD，LOD、LOQ分别是信噪比S/N为3、10是样品检测浓度结果表2。

表2 马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷对照品色谱峰面积回归方程与线性范围

2.4 样品稳定性及仪器精密度

取样样品2除去杂质粉碎过100目筛后0.2g定容至25ml容量瓶中，甲醇超声处理30min，静置至室温后补足体积，分别在0-24小时内检测样品，考察马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷对应峰面积RSD分别为2.68%、4.56%、2.51%及其他分离度较高的峰面积RSD（n=6）。

2.5 重复性

样品2除去杂质粉碎过100目筛后取样五份，每份0.2g，加入相同混标准液的并定容至25ml容量瓶中，甲醇超声处理30min，静置至室温后补足体积，混匀后取1ml过0.22μm有机相滤膜至进样瓶中等待分析测定样品中马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷含量，其RSD分别为1.78%、1.87%、0.98%.样品共有峰不包括马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷的编号4、5、6、7、8、9的共有峰考察，在重复性实验中评价共有峰其峰面积的重复性及稳定性RSD分别为5.59%、0.80%、0.99%、1.91%、1.29%、0.61%、2.48%（n=5）。

2.6 添加回收试验

取样样品2除去杂质粉碎过100目筛后2g定容至250ml容量瓶中，甲醇超声处理30min，静置至室温后补足体积，在样品2供试液中分别添加马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷，其中马钱苷酸添加水平分别为0.03、0.06、0.12g/L獐牙菜苦苷分别为0.01、0.02、0.04g/L、龙胆苦苷0.75、1.5、3g/L（n=5）混匀后取1ml过0.22μm有机相滤膜至进样瓶中等待分析测定样品中马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷含量。

表3 蓝花龙胆3种成分加标回收率

2.7 样品处理与检测

样品除去杂物后分离花、茎、全草，分别粉碎过100目筛，精确称取0.20g样品至于25ml容量瓶中，移液器加入25ml甲醇超声处理30min，静置至室温后补足体积，混匀后取1ml过0.22μm有机相滤膜至进样瓶中等待分析测定样品中马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷含量（表4）。

表4 不同样品不同部分3种成分百分含量

2.8 共有峰考察及指纹图谱分析

不同样品特征峰主要集中在16-35min，共有峰图谱见（图1），其中1-3号峰分别为马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷，其他共有峰面积信息见表5。采用重要色谱指纹图谱相似度评价系统2004A分析不同蓝花龙胆样品花与茎和不同蓝花龙胆样品的相似度。花与全草的相似度较茎部高，同一药材不同部位考察色谱图相似度可确定样品（图2）与经典分类观察结果一致。

表5 共有峰面积表

表6 滇龙胆林药复合栽培模式下药材指纹图谱相似度评价结果

图1 不同蓝花龙胆样品花部液相色谱图

图2 蓝花龙胆花16-36min指纹图谱

图3 蓝花龙胆样品270nm与240nm对比

3 分析讨论

通过比较240、254、270、290nm等 8个波段指纹图谱和不同峰全波段扫描结果显示240、254、270nm共有峰明显且较多，马钱苷酸与獐牙菜苦苷最大吸收约在240nm且含量较低，而龙胆苦苷最大吸收约270nm有较高的含量，最终选择240nm保证马钱苷酸与獐牙菜苦苷有效的检出，并反应出药材自身特性（图3）。文中看出药材自身不同部位存在差异，且不同药材之间也存在较大差异，分析的蓝花龙胆花中龙胆苦苷含量高于茎中，高于全草中含量，部分样品中龙胆苦苷不能达到3%，但都高于1.5%，部分样品獐牙菜苦苷含量变化差异较大，而马钱苷酸含量变化差异小。通过样品之间谱图共有峰及峰面积考察，可看出样品主要特征峰在35min内全部出现，集中出现在16-35min。藏药材质量是藏药质量的基础，实际工作中可作为一种快速鉴定和评价藏药材蓝花龙胆药材质量的方法。

传统上藏医对蓝花龙胆以花用药，通过指纹图谱评价不同样品，不同样品花和茎叶指纹图谱存在差异大于花与全草指纹图谱，指纹图谱存在一定相似性，全草入药是或许是可行的。以龙胆苦甙为标志性物质，从道地药材角度上分析，我们更应该尊重藏医用药传统，采用花入药，同时对药材生物分类学种上应加以限制并进行质量评价，建立蓝花龙胆指纹图谱评价系统，依托该方法用来龙胆品种区分与质量评价是可行的，同时该方法可应用于筛选评价道地民族药材。蓝花龙胆仅是藏药材中一种，类似存在多种藏药材如绿绒蒿、虎耳草等，存在类似情况，提升民族医药品质，在藏药中建立道地药材标准函待解决。

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