遗传多样性改变了临床现象，让甲型流感病毒检测充满挑战

菲利普·高格尔，兽医学博士，理学硕士，博士，爱荷华州州立大学副教授

甲型流感病毒仍然是美国养猪业面临的最严峻的健康挑战之一，更糟糕的是，患病风险可能还在增加。根据爱荷华州州立大学兽医诊断实验室的猪呼吸道样本数据，在过去的七年里，与流感相关的猪呼吸道病例数量一直在上升。(图1)。

甲型流感病毒是目前被诊断为单一病原体或vdL.2混合感染的猪呼吸道疾病的第二常见病因，这是一项基于对病毒和相关的、肺部微小病变的检测。（图2）。众所周知，甲型流感病毒也是导致猪呼吸道疾病的一个重要成分。

世界各地流行的三种甲型流感病毒亚型分别是H1N1、H1N2和H3N2。虽然流感是一种人畜共患病，可以从猪传染给人类，但我们应该清楚的是，人类流感病毒也可以传染到猪。1930从猪中分离出的第一株H1N1病毒，起源于1918年的西班牙人类流感大流行。H3N2是一种重组甲型流感病毒，最初起源于1998.4，由人类传染给猪。自那时以来，人类流感病毒继续影响猪体内传播的甲型流感病毒毒株，包括2009年H1N1流感大流行，随后又传染给猪。另外基因重组和突变导致猪体内循环的不同基因菌株的数量显著增加。

图1 2003年至2016年间，爱荷华州大学兽医诊断实验室型流感病毒呈阳性的诊断病例数

图2 2016年爱荷华州州立大学兽医诊断实验室诊断的猪呼吸道病例百分比

有几个因素使情况更加复杂：

1.这种病毒很容易传播。

2.大量的猪进行远距离移动以供饲养和加工，从而使地方病的甲型流感病毒能够传播到偏远地区的其他猪群。

3.在猪密度较低的地区，有少数猪场能够在它们的畜群中预防流感，但这种感染在其他地方是普遍存在的。

4.临床表现可能不同。

猪肉行业的许多人都记得多年前暴发的流感。猪出现深层次的阵发性或“吠叫”性咳嗽，这种咳嗽很快影响到大多数的猪群。由于肺炎的严重程度，猪可能会出现呼吸窘迫。发病率通常很高，但死亡损失很低，猪很快就恢复了免疫力，感染也因此消失。

今天，流感的典型临床表现各不相同。猪的临床症状可能较轻，只会轻微咳嗽。任何年龄的猪都可能感染甲型流感病毒，包括哺乳仔猪。甲型流感病毒感染初期可能只是轻微但持续的咳嗽，生产者通常不会将这种咳嗽与流感联系起来，从而忽视了这种疾病。当同一群仔猪断奶并转移到苗圃时，随着病毒在母亲抗体下降的同时传染给易感仔猪，咳嗽可能会变得更加普遍。

在其他情况下，母猪抗体的下降可能导致其在怀孕后期感染流感。在这个年龄，流感的临床表现可能不那么引人注目，但可以持续到最后阶段，与几年前观察到的快速发病不同，这对甲型流感病毒的临床表现、生产及经济损失有重要意义。

此外，甲型流感病毒的遗传多样性有时会使甲型流感病毒疫苗难以跟上病毒的流行株，这也是为什么生产者可能使用自体疫苗。甲型流感病毒在美国及其容易传播，仅靠生物方法很难预防感染。此外，iv-S的遗传多样性有时也有变异。商用甲型流感病毒疫苗很难跟上病毒的流行株，这也是为什么生产商可以使用自体疫苗。然而，最近该行业获得了含有4至5株甲型流感病毒的商业疫苗，这是一项非常重要的发展。

检测活动性感染

毫无疑问，新的或正在出现的菌株的存在和该疾病的各种临床表现使甲型流感病毒的检测、诊断和监测更具挑战性。由于感染时间相对较短，或由于甲型流感病毒的发病率较低，检测活动性感染和诊断与甲型流感病毒相关的临床疾病可能比较困难。此外，选择哪种猪取样和正确采集样本是极其重要的，这就是为什么兽医应该参与以确保取得最大成效。

适合于在活猪中检测甲型流感病毒的样本包括单个鼻拭子或鼻拭子。菲利普博士经常被问到要用什么类型的拭子来检测像IAV这样的病毒。诊断实验室更喜欢带有塑料轴的合成棉签(涤纶、人造丝或涤纶)。为防止拭子过于干燥，需要大约1到2毫升的液体，不要使用凝胶材质的。鼻巾不太常用，但当使用鼻巾时，用2英寸x2英寸的棉纱擦拭猪的鼻子，然后放入5毫升的液体输送介质中。尽量不要交叉污染猪之间的擦拭物，以保持样品的完整性。

取样提示

在感染猪的早期，也就是当猪的病毒排出量最大的时候，检测猪流感是最有效的。排出病毒始于感染后的24小时，持续时间大约为5到8天。甲型流感病毒在猪群中的传播速度取决于猪的年龄、甲型流感病毒毒株、本身的免疫力、是否存在混合感染和其他环境因素。

当从猪的种群中收集个体样本时，重要的是选择代表种群临床症状的动物。例如，如果要观察呼吸道疾病，就需要从出现昏睡和咳嗽的猪身上采集样本。根据预期的感染率，至少要采集10到30头受影响的猪。

然而，当呼吸道疾病不严重时，选择合适的取样是很困难的，这是典型的乳猪，在产房里有轻微、周期性咳嗽。在这些病例中，我成功地从发烧的乳猪(104°F或40℃)的鼻拭子中检测到流感，

乳猪的甲型流感病毒流行率很低，通常在2%或者更少，因此我们需要从大量仔猪中采集样本，每个产房至少要采集60头猪的鼻拭子。一些诊断测试可以分成五组，以降低测试成本。

口服液取样

口服液样本也适用于苗圃、种植者或育肥猪的种群监测，这是一种非侵入性的方法。它通常很容易。3周龄以下猪(哺乳猪)的NG口服液可能很困难，需要训练才能成功。使用一根5/8英寸的棉绳挂在猪的肩部高度的一支笔里，允许猪在绳子上咀嚼20到30分钟。绳子的末端放在塑料袋里，然后挤压。让液体收集到袋底。然后，唾液被倒进圆锥形管，这个圆锥形管应该被紧紧地固定住，以防止在运送到实验室的过程中泄漏。样品必须是小心处理以防止交叉污染。收集后应尽快冷藏，并随冰袋运出。

口服液的优点是具有代表性。这有助于检测出可能在猪体内不均匀地循环的甲型流感病毒。临床症状出现时，应收集其口服液体，每一百只动物使用一根绳子，并应将绳索均匀地隔在谷仓内。

最后，如果猪需要进行安乐死，可以收集死后样本。新鲜的肺样本提交至病毒检测，但是只需要没有慢性感染或混合感染的猪，最好是来自未接受抗生素治疗的猪。

图3 不同阶段检测甲型流感病毒的取样类型测试方法

由于甲型流感病毒的流行状况和疫苗的使用，血清学诊断甲型流感病毒的价值值得商榷。例如，ELISA试验(酶联免疫吸附试验)不会区分由自然感染引起的抗体、疫苗或母体抗体之间的相互作用。因此，ELISA检测方法应应用于确定是否存在甲型流感病毒抗体。

另一项血清学试验是血凝抑制，也称为HI。它是检测抗甲型流感病毒抗体的良好指标。不幸的是，由于不同毒株的甲型流感病毒在这种测试中可能不会发生交叉反应，所以甲型流感病毒的多样性使得HI扩散。因此，使用甲型流感病毒来检测猪的血清是很重要的，如果适当的话，这种甲型流感病毒可以在畜群中流通，也可以用于特定的农场疫苗中。现场样品需要针对代表不同H1和H3病毒的甲型流感病毒毒株进行测试，以提高检测灵敏度。

为了监测人群中的甲型流感病毒，我们对阳性样本进行了基因测序。这不仅能揭示甲型流感病毒是否存在，而且还能准确定位循环亚型和遗传簇。兽医和生产者必须知道哪种病毒在他们的猪体内传播，这增加了对基因测序的需求。

在一群甲型流感病毒监视器，聚合酶链反应检测是对阳性样品的基因测序完成，这不仅将揭示是否甲型流感病毒目前也确定循环目的亚型和遗传聚类。兽医和生产者必须知道哪种病毒在他们的猪体内传播，这增加了对基因测序的需求。

无论生产者和兽医决定做什么测试，重要的是要保存好结果的记录，以便与未来的测试进行比较。你会想知道甲型流感病毒病毒是否已经改变，这显然会影响疫苗接种计划。

90多年来，流感已被认为是猪的一种呼吸道病原体。尽管病毒在不断变化，对养猪业来说，甲型流感病毒的管理仍然是一个巨大挑战，诊断方法也在不断改进。

在未来，新的疫苗平台可能会被批准，这可能会显著影响我们控制甲型流感病毒的能力。此外，兽医和养猪者还需要对甲型流感病毒进行监测，以检测新的或正在出现的病毒株，以便在必要时能够更新疫苗。对于生产者来说，参与美国农业部的甲型流感病毒监测计划是一种非常好的方法，帮助监测甲型流感病毒在猪群体内的存在。