2009—2011年南京地区儿童急性呼吸道感染人冠状病毒HKU1和NL63临床与流行病学特征

闫坤龙 谢志萍 高寒春 高小倩 金玉 段招军

210008,南京医科大学附属儿童医院消化科(金玉、闫坤龙)；100052北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(谢志萍、高寒春、段招军)

急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection,ARTI)是世界范围内婴幼儿发病和死亡的主要原因,是导致5岁以下婴幼儿死亡的首要病因[1],在儿童的急性呼吸道感染病原中90%以上是由病毒性病原引起,冠状病毒是主要致病原之一[2]。人冠状病毒分型包括20世纪60年代发现的冠状病毒OC43和229E；21世纪初发现的冠状病毒HKU1和NL63,以及具有强烈传染性的冠状病毒SARS和MERS[3]。冠状病毒HKU1和NL63作为近些年发现新型冠状病毒在南京地区的临床和流行病学资料较少,特别是关于儿童急性呼吸道感染疾病的研究,因此,本研究于2009年8月份至2011年7月份对南京地区儿童冠状病毒HKU1和NL63的感染情况进行了研究,对比分析了本地区两种病毒在儿童中的临床和分子流行病学特征。

1 材料与方法

1.1 研究对象与标本采集

1.1.1 研究对象：2009年8月份至2011年7月份,收集因急性呼吸道感染于南京医科大学儿童医院就诊和住院的患儿呼吸道分泌物标本1 286份,其中鼻咽抽吸物标本795份,咽拭子标本491份。

1.1.2 标本采集：对于鼻咽抽吸物标本采集：使用一次性无菌吸痰管对纳入研究的患儿在就诊当天经单侧鼻腔插入,深度7～8 cm,负压吸取咽部分泌物1～2 ml,置于无菌采集管内,在超净工作台内加入2 ml病毒保存液(含青霉素、链霉素和两性霉素B浓度均为200 U/ml,0.125%BSA),旋涡振荡器上震荡混匀,置于-80℃低温冰箱保存至检测。对于咽拭子标本采集：以无菌棉拭子吸附无菌生理盐水,采集两侧腭弓、咽部或扁桃体黏膜上的分泌物,放入含2 ml病毒保存液的灭菌冻存管中,置于-80℃低温冰箱保存至检测。本研究经南京医科大学附属儿童医院医学伦理委员会批准,征得患儿监护人知情同意。

1.2 实验方法

1.2.1 标本处理和病毒RNA提取：将采集的样本室温溶解,置旋涡振荡器上充分振荡混匀,1 500×g离心10 min,吸取上清,使用QIAmp病毒RNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)提取病毒RNA,操作步骤严格参照说明书。

1.2.2 HCoV-HKU1和HCoV-NL63核酸检测：提取的RNA以随机引物,采用反转录酶SuperScript®Ⅱ(美国Invitrogen公司)反转录合成cDNA后进行病毒检测。具体操作方法参考文献[4-5],每次反应均设立阳性、阴性对照。扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,阳性产物进行核苷酸序列测定,弱阳性标本经QIAquick DNA凝胶纯化回收试剂盒(德国Qiagen公司)纯化回收后,使用T4连接酶连接到pGEM-T载体(美国 Promega公司)置于4℃环境中过夜,然后将连接产物转化感受态细胞DH5a,将筛选为阳性克隆的菌落挑取后培养的菌液进行核苷酸序列测定。

1.3 序列测定及分析测序反应由商业测序公司完成。使用DNAman软件编辑测序序列,序列分析采用美国生物医学信息中心(NCBI)的在线工具Blast,并采用MEGA7.0软件绘制基因的系统进化树。比较和进化分析所采用的基因序列GenBank序列号如下：HCoV-HKU1(NC-006577,DQ415914,DQ415911,DQ415912)；HCoV-NL63(AY567487,KF530113,KF530110)；HCoV-OC43(KX344031,KF530098)； HCoV-229E(NC-002645)；PEDV(NC-003436)；TGEV(NC-002306)；FIPV(NC-002306)；MHV(AF201929)；BCoV(NC-003045)；HCoV-SARS(AY274119)；HCoV-MERS(KT225476)。

1.4 混合感染分析经检测为HCoV-HKU1或HCoV-NL63阳性标本,采用PCR或RT-PCR方法,进行其他常见呼吸道病毒检测[6],包括腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(HRV)、流感病毒(IFVA和 IFVB型)、副流感病毒(PIV1-3型)、偏肺病毒(HMPV)以了解病毒性病原混合感染的情况；同时对鼻咽抽吸物标本进行了细菌学培养,以了解细菌性病原混合感染情况。

1.5 临床资料分析临床资料调查表为根据研究设计的统一表格,由采集标本者在采集标本后填写,结合检测结果,对HCoV-HKU1和HCoV-NL63在呼吸道感染儿童中的临床和流行病学特点进行总结分析。

1.6 统计学方法统计学处理采用SPSS 21.0软件,计量资料采用秩和检验,对于计数资料以Chisquare检验或校正Chi-square检验进行组间比较。

2 结果

2.1 一般资料2009年8月份至2011年7月份共收集1 286份,男性患儿876例,女性患儿410例,男女之比为2.1∶1；鼻咽抽吸物标本795份,咽拭子标本491份,门诊采集样本432例,其中上呼吸道感染339例,下呼吸道感染93例,住院采集样本854例,均为下呼吸道感染。HCoV-HKU1和NL63总检出率为2.6%(33/1 286),其中检测到HCoV-HKU1阳性扩增产物14份,检出率为1.1%(14/1 286),HCoV-NL63的阳性扩增产物19份,检出率为1.5%(19/1 286)。

在HCoV-HKU1阳性病例中,男性患儿10例,女性患儿4例,性别差异在病毒检出率中无统计学意义(χ2=0.067,P＞0.05)。432例门诊患儿检出HKU1核酸阳性5例,854例住院患儿检出HKU1核酸阳性9例,门诊和住院患儿检出率之间差异无统计学意义(χ2=0.029,P＞0.05)。阳性病例中位数年龄为6.8月(1.4月～43月)。其中6个月以下患儿369例,HKU1核酸检出6例,阳性率1.6%,6个月～12月患儿279例,检出5例,阳性率1.8%,1岁～3岁患儿285例,检出2例,阳性率为0.7%,4岁～6岁患儿266例,检出1例,阳性率为0.38%,6岁以上患儿87例,无阳性标本(季节分布情况见图1)

在HCoV-NL63阳性病例中,男性患儿11例,女性患儿8例,性别的差异在病毒检出率中无统计学意义(χ2=0.928,P＞0.05)。432例门诊患儿检出HCoV-NL63核酸阳性12例,854例住院患儿检出HCoV-NL63核酸阳性7例,门诊和住院患儿检出率之间差异具有统计学意义(χ2=146.9,P＜0.05)。阳性病例中位数年龄为14个月(3.6个月～76个月),其中6个月以下患儿369例,HCoV-NL63核酸检出3例,阳性率0.8%,6个月～12个月患儿279例,检出3例,阳性率1.1%,1岁～3岁患儿285例,检出10例,阳性率为3.5%,4岁～6岁患儿266例,无阳性标本,6岁以上患儿87例,检出1例,阳性率为1.1%。(季节分布情况见图1)

图1 冠状病毒HKU1和NL63检出的季节分布Fig.1 Seasonal distribution of coronavirus HKU1 and NL63

2.2 临床特征分析HCoV-HKU1核酸阳性标本均采集于下呼吸道感染病例,临床诊断包括支气管炎7例、支气管肺炎6例、毛细支气管炎1例,临床症状为咳嗽(100%,14/14)、发热(64.3%,9/14)、喘息(57.1%,8/14)、咳痰(57.1%,8/14)；临床体征为呼吸音增粗(100%,14/14),喘鸣音(50.0%,7/14),痰鸣音(21.4%,3/14),细湿啰音(21.4%,3/14),气促发绀(7.1%,1/14),鼻导管吸氧1例,中位数住院日8 d。无死亡病例。(表1)

HCoV-NL63核酸阳性病例包括门诊上呼吸道感染11例和下呼吸道感染1例,住院下呼吸道感染病例7例,临床诊断为急性上呼吸道感染(57.9%,11/19)、支气管肺炎(31.6%,6/19)、支气管炎(5.3%,1/19)、毛细支气管炎(5.3%,1/19),临床表现为发热(78.9%,15/19)、咳嗽(47.4%,9/19)、咳痰(47.4%,9/19)、喘息(21.1%,4/19)；临床体征为呼吸音增粗(52.6%,10/19),喘鸣音(26.3%,5/19),痰鸣音(26.3%,5/19)。中位数住院8 d。无死亡病例。(表1)

HCoV-HKU1与HCoV-NL63阳性病例组间比较临床症状、体征和辅助检查无统计学差异(P＞0.05)；门诊与住院病例、呼吸道感染部位在组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。(表1)

2.3 混合感染分析在14份HKU1核酸阳性病例中,1例为单独感染,13例为病毒性病原的混合感染,病毒性病原的混合感染率92.9%,其中5例为3种病毒混合感染,8例为2种病毒混合感染,最常见的混合感染病毒为人呼吸道合胞病毒(6例),人副流感病毒3型(5例),人腺病毒和人偏肺病毒(各2例)。HKU1阳性病例中9例有细菌混合感染,其中混合感染流感嗜血杆菌4例,肺炎链球菌3例(其中1例混合感染金黄色葡萄球菌),卡他布兰汉菌和聚团泛菌各1例。

表1 HKU1和NL63感染病例的临床特征Tab.1 Clinical features of coronavirus HKU1 and NL63 infection cases

在19份NL63核酸阳性病例中,7例为单独感染,12例为病毒性病原的混合感染,病毒性病原的混合感染率为63.2%,其中2例为3种病毒混合感染,10例为2种病毒混合感染,最常见的混合感染病毒为人腺病毒4例,流感病毒A型3例,人博卡病毒、人呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、人副流感病毒1、2、3型和人偏肺病毒各1例。NL63阳性病例中,7例行细菌培养4例有细菌混合感染,其中肺炎链球菌、产酸克雷伯菌、奇异变形菌、奈瑟氏菌各1例。

2.4 基因检测及分析本研究共检测出冠状病毒HKU1阳性扩增产物14份,均在490 bp左右处表现为单一特异性条带,与预期目的片段聚合酶基因pol片段相符,阳性样本的测序结果GenBank中HCoVHKU1基因序列进行Blast比对,核苷酸同源性在98.2%～100%之间。在阳性标本中,2010年采集标本检出6份,其中A基因型5例,B基因型1例；2011年采集标本检出8例,A基因型1例,基因型B型7例。冠状病毒NL63的阳性扩增产物19份,均在250 bp左右处表现为单一特异性条带,与预期目的片段N基因片段相符,2009年所采集标本检出13例,2010年所采集标本检出3例,2011年所采集标本检出3例,阳性样本的测序结果与GenBank中HCoV-NL63基因序列进行Blast比对,核苷酸同源性在95.6%～100%之间。

3 讨论

本研究结果显示2009—2011年的连续两年的流行病学筛查 HCoV-HKU1和 NL63总检出率为2.6%(33/1 286),HCoV-HKU1检出率为1.1%(14/1 286),HCoV-NL63的检出率为1.5%(19/1 286)。目前世界各地相继报道有 HCoV-HKU1和HCoV-NL63检出,阳性率在1% ～10%[7]。HCoVHKU1在各季节均有检出,婴幼儿的感染风险较高,临床诊断以肺炎居多。与其他呼吸道病毒混合感染较常见。

本研究HCoV-HKU1检出率1.1%,较兰州地区的检出率为低[8],低于以往南京地区报道冠状病毒的总检出率,但是高于其10岁以下人群的检出率[9],在检出率、季节分布、人群分布与武汉地区儿童人群报道相似[10]。本研究HCoV-HKU1阳性病例均在下呼吸道感染患儿中检出,与湖南以往研究一致[11],表明其可能引起病情较重的下呼吸道感染,但因混合感染率92.9%,所以有待更进一步的研究明确其致病性。病毒性病原混合感染分析人呼吸道合胞病毒和人副流感病毒3型是其主要的混合感染病毒性病原,本研究结果与兰州地区的报道一致[8]。本组HCoV-HKU1阳性标本主要分布在冬春季,人群分布以1岁以下婴幼儿为主,随着年龄增长检出率呈下降趋势。感染患儿的临床表现无特异性。HCoV-NL63检出率1.5%,与南京地区报道的10岁以下人群的检出率比较为高[9],本组HCoVNL63阳性标本主要分布在夏季和秋季,在8～9月份出现流行高峰,人群分布主要在1岁～3岁幼儿,感染患儿的临床表现无特异性。本研究较兰州地区报道的检出率低,但季节分布、人群分布相似[12],但是与广州地区在夏季和冬季呈双流行高峰的季节分布特点不同[13],分析本研究报道与兰州地区检出率的差异、广州地区流行特点的不同可能与地理及气候因素有关；与本地区以往报道的差异可能由研究人群的构成不同所导致。本研究HCoV-NL63阳性病例病毒性病原的混合感染率为63.2%,最常见合并感染病毒性病原为人腺病毒和流感病毒A型,分析原因可能是HCoV-NL63与人腺病毒和流感病毒A型流行季节重叠有关。

HCoV-HKU1首次被发现于患有呼吸道和心血管系统基础疾病的老年人群中[14],中国香港地区报道11例儿童感染患儿,8例有基础疾病；同样,美国报道的9例HCoV-HKU1感染患儿,5例患有基础疾病[15]。以上研究表明HCoV-HKU1感染可能会导致基础疾病的加重而需要住院治疗,受感染人群主要为免疫力低下者。本研究的14例HCoV-HKU1感染患儿均为住院患儿,14例阳性病例有11例患儿的年龄小于1岁,因婴幼儿免疫力尚未发育成熟,故研究结果同样证实HCoV-HKU1感染主要影响免疫力低下的人群。HCoV-NL63感染与呼吸道疾病的致病性已经明确,可引起相对温和的呼吸道感染症状如发热、咳嗽、咽痛和流涕[16]。本研究HCoVNL63阳性患儿以上呼吸道感染为主,研究结果与上述报道大致类似。

我们采用RT-PCR方法扩增HCoV-HKU1聚合酶pol和HCoV-NL63的N基因片段,共检测到33份阳性标本,其中 HCoV-HKU1阳性标本14份,HCoV-NL63阳性标本19份,经测序分析分析与已公布的标准株序列同源性在98.2% ～100%和95.6%～100%之间,证实其为冠状病毒 HCoVHKU1和HCoV-NL63。经过进一步系统进化分析结果表明,14例HCoV-HKU1核酸阳性样本种A基因型6例,B基因型8例,在连续2年的研究中表现出2种基因型交替流行的特点；HCoV-NL63则表现为单一基因型的流行。

综上所述,通过对南京地区急性呼吸道感染患儿呼吸道分泌物中HCoV-HKU1和HCoV-NL63基因的检测和基因分析初步掌握了该病毒在本地区的临床和流行病学特征,由于HCoV发病率较低,阳性病例数较少,加之本研究的时间短,尚不能完全明确其在儿童急性呼吸道感染中的整体性规律,需进一步大样本长时间的广泛深入研究,以更好地了解HCoV在儿童急性呼吸道感染中的病原学作用和流行病学特征。

利益冲突无