泉州地区2014—2017年活禽相关外环境禽流感病毒监测及遗传进化特征

郑友限 刘建忠 李锋平 陈志扬 陈明春 吴小凤

362000泉州市疾病预防控制中心

2013年以来我国多地相继发现人感染H7N9禽流感病毒(avian influenza,AIV)病例,已经造成多人死亡[1]。2014年1月以来泉州地区相继出现了12例病例,死亡2例[2-3]。AIV属于甲型流感病毒,主要感染禽和鸟类,至今发现能直接感染人类的主要有 H5、H7和 H9等亚型。目前,我国人感染H7N9禽流感呈现高度散发,人感染禽流感主要是由于接触感染病毒的禽鸟及其分泌物和排泄物。2016年10月,广东、湖南等地又发现对禽高致病性病毒毒株[4]。为了解泉州地区外环境禽流感病毒的动态分布状况,本研究自2014年开始,对本地区活禽养殖场、活禽交易和宰杀市场、农贸交易市场以及野生禽鸟栖息地等外环境标本进行监测,全面了解外环境中H5、H7和H9等亚型禽流感病毒分布情况,并从分子水平分析其基因特征和遗传变异特点。

1 材料与方法

1.1 研究对象2014—2017年泉州地区的12个县(市、区),于每月定期开展一次监测,采用随机抽样的方法选择活禽批发市场、家禽屠宰加工点、家禽规模养殖场(户)以及野生禽鸟栖息地等场所作为外环境监测点。采集禽类饮水、粪便、笼具表面拭子、清洗禽类污水、宰杀或摆放禽肉案板表面拭子以及野生禽鸟栖息地的粪便等标本共1 289份。在发生人禽流感疫情期间,则在疫点开展应急监测,相应扩大监测点,增加标本采样量。

1.2 病毒核酸提取标本采集完成后,4℃保存送至泉州市疾病预防控制中心实验室,采用江苏硕世生物科技有限公司的病毒核酸提取试剂盒(磁珠法),用全自动核酸提取仪SSNP-2000 A对采集的标本进行病毒RNA提取,具体操作参照试剂盒和仪器使用说明书。

1.3 实时荧光定量逆转录PCR(Real-Time RTPCR)检测甲型流感病毒及H5、H9和H7N9的检测均采用深圳生科原生物技术有限公司的相应产品进行,具体操作参照产品说明书。检测仪器为LightCycler 480 II实时荧光定量PCR仪。

1.4 H7N9禽流感病毒序列测定与同源性分析

选择Real-Time RT-PCR检测为H7N9阳性的样本,利用Promega公司的逆转录试剂盒以及流感病毒通用引物uni12(agcaaaagcagg)进行逆转录合成cDNA。利用本实验室设计的片段特异性引物和TaKaRa公司的Pyrobest DNA Polymerase进行扩增。扩增产物用QIAquick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒回收后送上海生工公司测序。测序产物的拼接采用DNAstar Lasergene7.1软件,先用MEGA7.0软件的Clustal W法进行序列比对,再采用Neighbor-Joining法分别构建HA和NA基因的进化树。本研究中其他人源、禽源H7N9禽流感病毒基因参考序列均来源于GeneBank和GISAID。

1.5 统计学方法采用SPSS16.0软件进行数据分析,率的比较采用卡方检验,P值小于0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2014—2017年外环境标本监测情况2014—2017年共采集1 289份外环境标本,检出377份甲型流感病毒核酸阳性(377/1 289),其中172份H7N9核酸阳性,49份H5核酸阳性,155份H9核酸阳性,1份未能分型。各年度H7N9亚型阳性率差别较大,其中最高的为2017年的21.88%,其次为2015年的18.45%,2014年和2016年则相对较低,分别为7.56%和7.28%,见表1。

2.2 不同场所不同类型标本H7N9禽流感病毒监测情况来自4种不同涉禽监测场所标本中,活禽交易和宰杀市场H7N9禽流感病毒阳性标本数最多(141份),阳性率最高(16.95%),其次为农贸市场,阳性标本17份,阳性率为16.50%,而禽类养殖场所则相对较少(阳性标本14份,阳性率为4.40%),野生候鸟栖息地则未检出H7N9亚型禽流感病毒。在任何监测场所,清洗禽类污水标本,阳性率最高为19.12%(52/272),其次为笼具表面擦拭标本H7N9禽流感病毒阳性率为14.58%(42/288),宰杀或摆放禽肉案板表面的擦拭标本以及粪便标本的 H7N9禽流感病毒阳性率,分别为12.10%(34/281)和10.16%(39/384),禽类饮水的H7N9禽流感病毒阳性率则相对较低,为7.69%(5/65),见表 2。

表1 2014—2017年泉州地区外环境标本禽流感病毒检测结果Tab.1 Detection results of H7N9 avian influenza virus in environment samples in Quanzhou during 2014-2017

表2 不同场所不同类型标本H7N9禽流感病毒检测情况比较Tab.2 Comparison of detection of H7N9 avian influenza virus in different places and different types of samples

2.3 H7N9禽流感病毒基因同源性与病毒毒力分析通过PCR扩增和测序分析,本研究获得了福建省泉州地区4株H7N9病毒的HA和NA基因全长,分别来自外环境标本QZ1613、QZ1708和人感染H7N9禽流感病毒患者标本QZ10、QZ11。进化分析结果显示,2株人源H7N9病毒的HA和NA基因都属于长江三角洲谱系,而2株环境样本来源的H7N9病毒的HA和NA基因都属于珠江三角洲谱系,见图1。对该4株H7N9病毒的HA、NA和PB2蛋白的关键位点的分析结果显示,这4株病毒HA蛋白的裂解位点均为PKGR/G,没有发生高致病性突变,属于低致病性H7N9禽流感病毒；NA蛋白292位(N2编号)氨基酸都为R,没有出现奥司他韦耐药突变；PB2蛋白中,627位氨基酸从E突变为了K,526位和701位氨基酸没有出现突变。

3 讨论

本研究对福建省泉州地区2014—2017年活禽相关外环境禽流感毒监测情况及遗传进化特性进行了分析比较。结果显示泉州地区活禽相关外环境中禽流感病毒污染较为严重,尤其是H7N9禽流感病毒,阳性率为 13.34%,其中以 2017年为最高(21.88%),污染率高的场所主要为家禽宰杀加工场所、活禽交易市场,而野生候鸟栖息地未检出H7N9,表明泉州地区活禽相关外环境是人感染H7N9病毒的高危场所,应加强监测。外环境标本检出率由高到低依次为清洗禽类的污水、笼具表面擦拭标本、宰杀或摆放禽肉的擦拭标本、粪便标本、禽类饮用水,清洗禽类的污水和宰杀或摆放禽肉的案板表面的H7N9禽流感病毒检出率相对较高,而粪便标本和禽类饮水的检出率则相对较低,表明在禽类销售、宰杀等环节中极易造成环境污染,尤其是宰杀环节中所用的水和案板等更容易被禽流感病毒污染,主要原因可能与不同类型标本受禽类交叉污染的严重程度不同有关[5]。对其中4株病毒的HA和NA基因序列进化分析,结果显示2株人源和2株环境样本来源H7N9病毒的HA和NA基因分别属于长江三角洲谱系和珠江三角洲谱系。尽管这4株病毒都是第5次疫情期间分离,但是在遗传进化上差别较大,提示这2个病例感染的病毒跟这两个环境样本中的病毒并没有直接联系。同时,这4株H7N9病毒毒株对禽类来说都是低致病性,NA蛋白都没有出现耐药突变,仍对奥司他韦敏感,但PB2蛋白都出现了与毒力相关的E627 K突变。

注：红色三角代表本研究的4株病毒序列图1 泉州市4株H7N9病毒HA(A)和NA(B)核酸序列遗传进化分析Note：The red triangle represents the 4 virus sequences in the articleFig.1 A,Phylogenetic analysis of HA(A)and NA(B)gene

本地的活禽批发交易和屠宰市场的直接暴露可能是导致H7N9禽流感病毒感染的高危因素。因此接触活禽或长期暴露在活禽相关外环境下均有可能导致人感染H7N9禽流感[6],建议相关部门在疫情暴发期间,加强源头防控,规范活禽市场管理其得病后风险极大应推行“三个一”制度,做好活禽经营市场交易场所、设施和运输工具的全面消毒清洁,以及个人防护等工作才是控制禽流感的长效措施[7]。每年9月到次年4月是人感染H7N9禽流感的高发期,应在秋季全面推进家禽H7N9疫苗免疫,进一步降低H7N9禽流感传播的风险,保障人群的安全。同时积极开展外环境禽流感病毒监测,掌握外环境中H7N9禽流感病毒的分布和变异情况,为预测预警流感流行趋势,及时采取预防控制措施提供科学依据。

利益冲突无