犬乳腺瘤的临床病理学分析

沈清霞， 苗懋东， 张 毅， 董 妍， 芮 荣* (.南京农业大学 动物医学院，江苏 南京 0095；.新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 83005)

宠物犬作为常见的伴侣动物，其健康问题一直倍受重视。随着现代医疗水平的提高，宠物犬的寿命得以有效延长，但伴随着环境刺激等因素的增加，肿瘤已成为危害犬只生命的一大杀手。肿瘤是动物机体内遗传物质改变造成细胞增殖、分化过程失控而形成的病理性赘生物，分为良性和恶性两种基本类型。影响犬肿瘤发病的因素很多，如动物品种、年龄等因素导致的免疫功能下降和内分泌失调，饲养环境中的各种理化刺激等，均可导致肿瘤的发生。在宠物犬肿瘤中，乳腺肿瘤在雌犬肿瘤疾病中占比较大，临床发病率达肿瘤病例数的50%或以上，且其中半数为恶性乳腺肿瘤[1]。犬乳腺肿瘤具有与人类乳腺肿瘤极为相似的分子生物学与临床特征，因此，犬是对肿瘤进行比较医学研究的理想动物模型。

相关研究认为众多临床因素如品种、年龄及肿瘤大小等，均可以影响犬乳腺肿瘤的发病及预后。因此本研究针对南京地区宠物犬临床肿瘤病例，应用临床统计学方法，对影响犬乳腺肿瘤的多方面因素进行研究分析，并根据新版WHO分类对犬乳腺肿瘤作出临床病理学诊断，为更好地了解犬乳腺肿瘤诊断及预后提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验时间段为2015年4月至2016年6月，在南京地区多家宠物医院共收集30例宠物犬乳腺肿瘤门诊病例，手术治疗时采集肿瘤组织；记录患犬完整临床诊疗资料(主要包括品种、年龄、瘤体大小、性别及绝育情况等)。采集非肿瘤性死亡雌犬的健康乳腺组织样本作为对照。患犬均为雌性，共包括贵宾、博美、蝴蝶等10个犬种。

1.2 肿瘤组织病理学诊断

将收集到的犬乳腺肿瘤组织取中心位置1 cm3大小，置于4%中性甲醛固定液中固定24 h后，常规方法制备蜡块。切片单位5 μm，HE染色，进行组织病理学分析。

1.3 生存时间统计

对所有有效病例自手术治疗后开始计算生存时间，每隔3～6个月电话回访，直到动物死亡(复发)统计结束，结果用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log rank检验比较组间生存率差异。

2 结果与分析

2.1 品种在乳腺肿瘤发病的关系

研究结果说明，犬乳腺肿瘤可发生于多品种之中。30例犬乳腺肿瘤病例中，共包含10个犬种，其中90%为小型犬只，贵宾犬发病率最高(33.3%)，博美犬排在第2(16.7%)，详见图1。

图1 犬乳腺肿瘤的品种分布情况Fig.1 The distribution of CMTs in breeds

2.2 年龄增长对犬乳腺肿瘤发病的影响

对犬乳腺肿瘤发病年龄分布统计详见图2。肿瘤患犬年龄从4～15岁不等，随年龄增加发病率升高。8岁为最常见发病年龄(26.7%)，8～13岁为主要发病区间(80.0%)，13岁之后发病的患犬数量有所下降。

图2 犬乳腺肿瘤在不同年龄发生数量的变化Fig.2 The changing number of CMTs in different ages

2.3 肿瘤大小与发病的联系

对手术切除后的犬乳腺肿瘤组织测量最大直径，记录分为3组：(1)<3 cm组10例；(2)≥3 cm且<5 cm组11例；(3)≥5 cm组9例。并将不同直径肿瘤分组中良恶性比例作图(图3)发现肿瘤大小分布平均(3组分别为33.3%，36.7%和30%)，最大直径在3～5 cm的肿瘤病例最多且其中恶性占比达到81.8%，其余2组良恶性之比相近(50.0%/44.4%)。

图3 肿瘤大小与发病的关系Fig.3 The relationship between tumor sizes and the incidence of CMTs

2.4 犬乳腺肿瘤的病理诊断

病理组织学诊断发现30例犬乳腺肿瘤包括良性12例(40.0%)：2例腺瘤、4例纤维腺瘤和6例乳头状瘤；恶性18例(60.0%)：3例导管内乳头状癌、5例混合癌和10例浸润性癌。其中浸润性癌发病率最高，占总发病率的33.3%，恶性肿瘤发病半数以上(55.6%)。将所有类型肿瘤排序如表1。

表1 不同犬乳腺肿瘤类型发病情况Table 1 The incidence of various canine mammary tumors

腺瘤是由高分化的腔上皮、肌上皮分别或共同形成的良性乳腺肿瘤，表现为腺管增生，外围纤维结缔组织包裹，但细胞大致形态与正常组织无异(图4.A)。乳头状瘤可分为导管内乳头状瘤以及非典型乳头状瘤，导管内乳头状瘤主要表现为导管膨大，腔上皮细胞大量增生呈树杈或团块状聚集于导管内(图4.B)。另一种非典型乳头状瘤，主要呈导管外增生，形成分枝、分叶状(图4.C)。

恶性肿瘤中浸润性癌非常常见，占本次研究所见恶性肿瘤的55.6%，主要特征表现为瘤细胞突破基底膜，在间质中浸润生长(图4.D、E)。这类肿瘤复发可能性大，预后不良。混合癌是此次研究发现的另一种常见恶性肿瘤，其恶性组分由腺上皮组织和肌上皮组织共同构成，间质有时可见化生现象(图4.F)。

图4 犬乳腺肿瘤的组织病理学特征Fig.4 Histopathological characteristics of CMTs

(A)腺瘤：纤维结缔组织将增生的腺管分隔开,增生腺管内充斥胶原纤维;(B)导管内乳头状瘤：导管内乳头状突起由大量形状均一的上皮细胞构成;(C)非典型乳头状瘤：增生的不规则导管占据整个视野，管腔内充斥胶原纤维。乳头状突起上覆盖的上皮细胞呈现细胞质液泡化;(D)浸润性癌：癌细胞突变基底膜在间质中浸润生长，无正常腺泡组织。癌细胞大小不一，含大量胞质，细胞核卵圆;(E)浸润性癌：癌巢中心粉刺样，外围细胞软骨化生。坏死细胞呈粉刺样大量分布于结缔组织之间;(F)混合癌：癌组织成分复杂，增生大量乳头状导管连片成巢，管腔大小不一。癌细胞异型性大，间质粘液化生，嗜碱性。

(A) Adenoma: The extensive ducts are surrounded by fibrous stroma,the ductal filled with collagen fibers.(B) Intraductal papilloma: The intraductal papillary covered a large number of uniform epithelial cells.(C) Atypical papilloma: Hyperplasia of the irregular ducts to occupy the entire field of view, the lumen filled with collagen fibers. Papillary processes covered epithelial cells showed cytoplasmic vacuolization.(D) Invasive carcinoma: cancer cell break basement membrane in the interstitial infiltrative growth, normal ducts invisible. Cancer cells vary in size, with a large number of cytoplasm, nucleus oval.(E) Invasive carcinoma: Cancer nest performed acne-like necrosis, peripheral cell cartilage metaplasia. Necrotic cells were a large number of acne-like distribution between the connective tissue.(F) Mixed carcinoma: The composition of neoplasm is complex, hyperplasia of a large number of papillary catheter into the nest, lumen size varies. Cancer cells showed pleomorphism, interstitial mucus metaplasia, basophilic.

2.5 良恶性肿瘤患犬不同的生存时间

由于部分病例畜主失联，30例肿瘤病例中共收集完整回访数据18例，其中良性肿瘤8例(44.4%)，恶性肿瘤10例(55.6%)。均由患犬实施手术治疗后开始计算生存时间，每个病例最后的状态均可分为2类：1——死亡或复发；0——失访或存活。

Kaplan-Meier生存分析曲线结果(图5)发现18例犬乳腺肿瘤病例，手术后中位生存期为14个月(1～20个月)，良性组中位生存期为15个月(6～20个月)，恶性组偏低为11个月(1～15个月)。良性肿瘤组患犬整体生存时间较恶性肿瘤组患犬长，但无统计学差异(P=0.196)。

图5 肿瘤类型与患犬生存时间的关系Fig.5 The relationship between tumor type and survival of the dogs

3 结论与讨论

犬乳腺肿瘤作为雌犬临床最常见的肿瘤类型，受到国内外临床兽医界的广泛关注。犬乳腺肿瘤与人类乳腺肿瘤在流行病学特征、临床表现及预后因素等方面又十分相似，可作为理想的动物肿瘤模型[2-3]。学界认为参与调控犬乳腺肿瘤发病和预后的因素十分复杂，包括类固醇性激素(特别是雌激素和孕酮)受体的活化，以及关键因子异常导致的某些细胞增殖与凋亡信号通路失调[4]，说明深入了解犬乳腺肿瘤生理特点对临床及病理学研究均十分重要。研究发现犬乳腺肿瘤在不同地区表现出特异的流行病学特征，因此本次研究就南京地区宠物犬乳腺肿瘤各临床因素与发病间联系以及常见乳腺肿瘤类型进行分析，为临床诊断及治疗提供参考。

3.1 品种、年龄、肿瘤大小等因素与肿瘤发病的联系

本次研究采集的30例临床犬乳腺肿瘤病例，涉及了10个犬种，其中9个为小型纯种犬，贵宾犬为发病率最高品种(33.3%)，其次是博美犬(16.7%)、蝴蝶犬(13.3%)，杂交犬占比很小(10.0%)。与Marta[5]等人发现纯种犬发病率是混血犬两倍的结果相似。研究发现乳腺肿瘤发病率为萨摩耶犬>杜宾犬>雪纳瑞犬>约克夏犬[5]，另有学者曾指出对于犬乳腺肿瘤，拳师犬、短毛猎犬、罗威纳犬、伯尔尼山地犬是发病率由高到低的品种排序，这与本次研究结果有所出入。本次研究中30例乳腺肿瘤患犬除3例杂交犬属于中大型犬，其余均集中于贵宾、京巴、博美等小型犬品种。分析认为国内外养犬品种的不同会造成这种差距，但乳腺肿瘤在品种间发病率有偏向这一事实可以确定，而对于不同地区应针对当地的养犬习惯做出高危品种建议，研究表明就南京地区而言应当将贵宾犬列为乳腺肿瘤高度关注犬种。

年龄与犬乳腺肿瘤的发生有明显的联系，未见1～3岁年龄段发病，4～6年龄段患犬也非常少见，而在8～13岁年龄段的发病率突增至80.0%，这之后又有所下降。数据结果与前人研究报道犬乳腺肿瘤发病年龄的中位值在8～10岁之间一致[5-6]。有研究表明在2～3.99岁之间犬乳腺肿瘤占所有犬肿瘤的10%，在4～5.99岁之间比例上升到35%，而到6～13.99岁时，乳腺肿瘤已是母犬首要的发病肿瘤类型(46%～50%)，14岁之后比例下滑至40%[7]。发生这种情况的主要原因是犬乳腺肿瘤的发病与机体激素含量关系密切，雌犬在生长过程中会经历周期性的发情及怀孕过程，在此过程中乳腺组织会发生相应的变化以促进乳汁分泌，造成乳腺组织突变概率上升。部分未绝育但从未生育的雌犬由于生理周期的破坏，肿瘤发病风险更高，1岁前进行绝育手术被认为是有效的控制手段[8-9]。

肿瘤大小或体积也是关于犬乳腺肿瘤预后中被研究最多的临床病理特征之一，理论上来说肿瘤越大，组织内突变累积相应增多，恶性行为的可能就越大[10]。参照经典TNM肿瘤分期法，笔者对手术切除后的肿瘤组织测量最大直径，记录分为三组：(1)<3 cm组10例；(2)≥3 cm且<5 cm组11例；(3)≥5 cm组9例。发现三组占比差异不大(33.3%、36.7%和30%)，但直径在3～5 cm的肿瘤病例恶性占比远远超过其他两组，达到81.8%，其余两组良恶性之比相近(50.0%和44.4%)。结果说明在3～5 cm时肿瘤癌变可能加大，印证了突变积累的理论，但肿瘤继续增大时恶性比例反而下降，分析可能是组织发生坏死的概率上升而遏制了进一步的恶化，需要后续试验验证。

3.2 犬乳腺肿瘤的病理学分类

病理学检查主要是指对临床肿瘤进行穿刺、活检或手术切除后的瘤体进行组织病理学染色观察的手段。犬乳腺肿瘤组织病理学诊断及分级在临床上是最重要最常用的诊断方法。

犬乳腺组织主要有实质、基质、导管、血管和神经这几个部分组成[11]。而乳腺肿瘤主要由腺上皮细胞、肌上皮细胞或是间质成分，某一个或联合的异常增生而引起。根据瘤细胞恶性程度，瘤体生长速度及方式等特征可分为良性肿瘤及恶性肿瘤两大类，而每一类根据瘤细胞来源的不同又主要可分为腺瘤(癌)、瘤(癌)、间质瘤(癌)。

由于犬乳腺组织结构较人类及猫科动物更为复杂，时常出现一份样本中多种肿瘤类型同时存在的现象，因此对犬乳腺肿瘤进行标准化的分类研究一直备受关注，本次研究主要根据经典WHO分类标准进行。研究收集30例犬乳腺肿瘤病料，经病理组织学诊断发现良性肿瘤12例(40.0%)：2例腺瘤、4例纤维腺瘤和6例乳头状瘤；恶性肿瘤18例(60.0%)：3例导管内乳头状癌、5例混合癌和10例浸润性癌，其中浸润性癌是总发病率第一(33.3%)的肿瘤类型。

3.2.1 良性犬乳腺肿瘤主要类型及病理学特点

(1)腺瘤：单纯型腺瘤是由排列在导管表面的细胞组成的，一般具有良好分界和完整基底膜的非浸润性病变。瘤变区域的间质结缔组织有时缺乏。导管衬以一层立方柱状上皮，部分细胞质可能出现嗜酸性特质，核质不均较为少见。

(2)纤维腺瘤：纤维腺瘤主要由大量广泛的疏松结缔组织组成，其中包裹着由立方形或柱型上皮细胞构成的小导管。成纤维细胞具有狭长的细胞核，很少的细胞质和不明显的细胞边缘。若为更长期的肿瘤具有更致密的纤维结缔组织，基质透明性增加。

(3)乳头状瘤(导管内乳头状瘤)：这种肿瘤特征是具有由纤维状支架支撑的乳头状突起，乳突可能单发或多发呈多节点的树杈状。导管常常出现膨大，由一层完整肌上皮细胞以及一层完整腺上皮细胞被覆。乳突基质主要由纤维组织、胶原等构成，核分裂象少见。

3.2.2 恶性犬乳腺肿瘤主要类型及病理学特点

(1)导管内乳头状癌：对于导管内乳头状癌，乳头被覆有多层(分层)增殖的上皮细胞群，其具有在导管内乳头状瘤中未发现的恶性特征，例如更高的核质比率，异型性增加，可见有丝分裂象。

(2)混合癌：可分为三种类型，第一种由恶性腺上皮和良性肌上皮组成；第二种为腺上皮成分以及肌上皮成分均为恶性；第三种特征在于不仅存在恶性肌上皮和肌上皮成分，间质结构也成骨化或软骨化的良性病变。

(3)浸润性癌：本研究中浸润性癌非常多见，其主要病理组织学特征为癌细胞向间质内广泛浸润性生长，造成正常间质组织中混杂各类癌细胞的情况。最常见的为浸润性乳头状癌，其排列成泡状或管状的癌细胞多数形态不一，排列散乱，异型性大，且核分裂象多见。

3.3 不同性质肿瘤的生存分析

肿瘤患犬手术后的随访是兽医临床最重要的判断生存情况的因素之一，本次研究共取得18例完整随访病例，8例良性肿瘤(44.4%)，10例恶性肿瘤(55.6%)。

18例犬乳腺肿瘤病例，手术后中位生存期为14个月，良性组中位生存期15个月，恶性组偏低为11个月。由中位生存期和生存曲线可以看出良性肿瘤组比恶性肿瘤组生存时间长，但未出现统计学差异，分析可能是样本量太少导致。

生存分析(Survival analysis)是指根据试验或调查得到的数据对生物或人的生存时间进行分析和推断，是研究生存时间和结局与众多影响因素间关系及其程度大小的方法。也可称为生存率分析或存活率分析，其中临床随访时间及方法是得到有效数据的最重要一步。兽医随访数据的获取有多种途径，部分研究是基于手术后患犬的定期临床检查，但大多数研究是依靠记录的回顾，对宠主或兽医进行问卷及电话调查，在今后临床工作中，需要临床兽医有意识引导宠主定期来院复查，根据影像学检查才能更好地判断淋巴结及远处转移情况。

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