ATF5在鼻咽癌组织中的表达及临床意义

冯光勇，张莹莹，张贵海

(遵义医学院附属医院肿瘤医院 头颈部科，贵州 遵义 563099)

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是常见的头颈部恶性肿瘤之一，其好发于亚洲东部、东南部，特别是我国南部及东南部，具有地区及家族聚集性。近年来，随着现代影像学和放疗技术的发展，鼻咽癌的诊治得到了一定的提高，但复发、远处转移是鼻咽癌治疗失败的主要原因之一。因此，如何延缓鼻咽癌进展及提高鼻咽癌局控率是目前研究的热点。ATF5 (Activating transcription factor 5)是属于bZip家族的转录因子，其家庭成员还包括CREB、FOS、NRF2等明星蛋白，ATF5不仅参与细胞的生长、分化、凋亡等过程，而且对细胞的应激、维持蛋白质稳态也具有重要意义，ATF5失调与肿瘤的发生、发展有关。在多数肿瘤细胞中，ATF5蛋白的上调将促进肿瘤细胞的存活、迁移、参与放疗抵抗，同时还能抑制自噬[1]；但在肝癌细胞中，ATF5高表达起着抑癌作用，高表达的ATF5蛋白预示着更好的预后[2]。关于ATF5在鼻咽癌中的表达情况目前鲜有报道，因此，本文通过鼻咽癌组织中ATF5蛋白表达情况，结合临床病理特征，探讨ATF5蛋白表达水平与鼻咽癌患者分期、临床特征的关系。

1 材料与方法

1.1 组织标本 收集遵义医学院附属医院病理科2010年8月至2017年4月共45例初诊鼻咽癌患者组织病理标本，所有患者治疗前均完成头颅(鼻咽部)及颈部核磁共振、胸部、腹部影像学及全身骨显像检查评估。根据国际抗癌联盟(UICC 2010)进行详细TNM分期，所有病患病理类型均为非角化型未分化鳞癌。均采用三维放疗，放疗期间均予以铂类药物为主的同期增敏化疗。其中，Ⅰ～Ⅱ期8例，Ⅲ～Ⅳ期(Ⅳ期包括Ⅳa、Ⅳb及Ⅳc期)患者37例，有远处器官转移14例，非远处器官转移31例，取5例癌旁组织作对照组。所有组织标本既往均经10%中性福尔马林固定液固定，常规石蜡包埋，本次实验行4 μm连续切片10张待用。

1.2 主要试剂 兔抗人ATF5抗体购自美国abcam公司，山羊抗兔IgG 抗体和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，苏木素购自美国Sigma公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.3 免疫组织化学染色 鼻咽癌组织石蜡标本连续切片脱蜡水化，使用3%过氧化氢阻断、灭活内源性过氧化氢酶，置0.01M枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中水煮修复抗原，自然冷却至室温，添加一抗(Anti-ATF5 antibody，工作浓度 1∶200)，置于4 ℃冰箱过夜，转至室温平衡30 min，添加二抗(兔kit，工作浓度 1∶400)，二氨基联苯胺(DAB)显色，显微镜下观察反应进度，自来水充分冲洗，苏木素复染细胞核，中性树胶封片。

1.4 结果判断 每张切片随机选择3个不同的视野(×200)显微镜下观察，并判断阳性表达强度和阳性率。染色结果采用半定量分析方法，以染色强度结合阳性细胞数百分比进行评分。染色强度以多数细胞呈现的染色强度并减去背景着色计分：无明显着色为0分，轻微为1分，中度为2分，重度为3分。阳性细胞百分比即每张免疫组化切片选择3个不同的视野(×200)观察：0～5%评为0分，6%～25%评1分，26%～50%评2分，51%～75%评3分，>75%均评为4分。对每个视野均进行染色强度计分与阳性细胞百分比评分，最终评分以阳性细胞百分比与染色强度的加和：0分为阴性(-)，小于4分为弱阳性(+)，4～6分为中度阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。将阳性细胞百分比与染色强度的评分相乘，乘积范围为0～12分，分值≤6分为低表达，分值>6分为高表达[3]。

1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，ATF5表达与鼻咽癌TNM分期关系采用秩和检验，ATF5表达与鼻咽癌临床特征关系采用χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同TNM分期鼻咽癌组织ATF5表达水平 结果(见图1)显示：ATF5蛋白在鼻咽癌组织中存在表达，根据染色结果，可定位于肿瘤细胞胞浆及部分胞核内；结果(见表1、图1)显示，早期鼻咽癌组织ATF5蛋白表达水平显著高于中晚期鼻咽癌组织的表达水平(P=0.018)。

表1鼻咽癌组织ATF5蛋白表达情况

分期例数ATF5阴性弱阳性表达中度阳性强阳性UPⅠ～Ⅱ80026-2.3620.018Ⅲ～Ⅳ37012511

2.2 ATF5蛋白表达与临床病理特征的关系 ATF5蛋白表达水平与鼻咽癌分期(P=0.046)、肿瘤病灶(T分期)(P=0.033)呈负相关，与鼻咽癌患者性别、年龄、淋巴转移情况、远处器官转移及EB病毒感染无明显相关性；见表2。

A:阴性对照;B:Ⅰ期;C:Ⅱ期;D:Ⅲ期;E:Ⅳ期，(SP ×200，边角×400)。图1 免疫组织化学法检测鼻咽癌组织ATF5蛋白的表达

表2鼻咽癌患者临床资料与Nav1.5蛋白表达的关系

类别ATF5 表达例数低表达(%)高表达(%)P 性别 男性 女性37823(62.2%)5(62.5%)14(37.8%)3(37.5%)0.998年龄 >50 ≤50232215(62.2%)13(59.1) 8(34.8%)9(40.9%)0.672分期 I～II III～IV8372(25.0%)26(70.3%)6(75.0%)11(29.7%)0.046病灶分期 T1～2 T3～420259(45.0%)19(76.0%)11(55.0%)6(24.0%)0.033淋巴分期 N0～1 N2～315309(60.2%)19(63.3%)6(40.0%)11(36.7%)0.828远处转移 M0(无) M1(有)311417(54.8%)11(78.6%)14(45.2%)3(21.4%)0.235EB病毒 阳性 阴性212412(57.1%)16(66.7%)9(42.9%)8(33.3%)0.511

3 讨论

ATF5是属于bZip家族的转录因子，参与细胞的生长、分化、凋亡及肿瘤形成，ATF5在调节多种组织的分化中起着重要作用，如大脑、骨、肝脏、脂肪等[1]，尤其是在神经组织上，研究显示[4-5]，沉默小鼠ATF5基因将导致脑室区神经细胞增殖明显减少，提示ATF5在调节神经细胞的生长及分化方面起着重要作用。同时ATF5在参与细胞应激及维持蛋白稳态方面也起着重要作用，细胞的应激反应(如热休克蛋白反应)将导致ATF5表达上调，上调的ATF5将介导分子伴侣、蛋白酶及prosurvival蛋白的转录，这些蛋白酶将维持细胞的稳态[6]。

失调的ATF5导致肿瘤发生、发展，调节肿瘤细胞的存活、迁移、抗辐射、抑制自噬，关于ATF5蛋白在肿瘤中的表达情况，有着截然相反的两种结果，在大多数肿瘤细胞中，ATF5表达与肿瘤的生存、恶性程度、侵袭能力及预后相关。研究显示[7-8]：ATF5蛋白高表达对胶质瘤细胞的生存至关重要，干扰ATF5表达将导致原发性肿瘤细胞胶质瘤死亡，但不影响肿瘤周围正常细胞的状态，相比之下正常的星形胶质细胞和神经元细胞并不依靠ATF5来存活[9]，ATF5在乳腺癌[10]、上皮性卵巢癌[11]、直肠癌[12]、胰腺癌细胞[13]中均存在高表达，提示ATF5高表达与肿瘤的生物学行为密切相关。ATF5与肺癌的侵袭性有关，沉默ATF5表达可以降低其侵袭能力[14]，在滤泡性淋巴瘤中，ATF5作为一种调控因子，参与疾病的进展[15]。但是在肝癌细胞中，ATF5在肝细胞中具有潜在的抗癌功能[16]，肝癌细胞中ATF5低表达提示更差的临床预后。本研究证实了ATF5蛋白在鼻咽癌组织中存在表达，且早期鼻咽癌组织中ATF5蛋白表达水平显著高于中晚期鼻咽癌组织表达水平，结合临床病理特征，进一步揭示了ATF5蛋白表达水平与鼻咽癌患者分期(主要是T分期)显著负相关,即高表达的ATF5预示着更早的临床T分期，低表达的ATF5预示着更晚的临床T分期。肿瘤T分期反应了肿瘤的局部侵袭能力，T分期越晚，肿瘤局部侵袭范围就越大。通过我们研究结果提示：在鼻咽癌中高表达的ATF5表现更低侵袭能力，低表达的ATF5拥有更强的侵袭能力，从而影响分期。但关于ATF5如何调控这一过程仍需要深入探索。

总之，ATF5拥有众多特性，是肿瘤治疗的潜在靶点，ATF5可以通过激活mTOR、BCL1、MCL1等信号通路参与蛋白质的转录，在肿瘤的生物学行为中具有重要作用[17]，ATF5作为一种转录因子，虽然不能用常规小分子靶向药物来控制，但ATF5调节药物作为一种创新、安全、高效的抗肿瘤药物是可行的[18]，可能成为未来肿瘤治疗的热点。

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