性别对成年小鼠心肌细胞收缩力的影响

牛小豆 李子健 张永珍

100191 北京大学第三医院心内科，血管医学研究所，卫生部心血管分子生物学与调节肽重点实验室，分子心血管学教育部重点实验室，心血管受体研究北京市重点实验室

循证医学证据表明，冠心病、高血压、心肌病和心力衰竭等多种心血管疾病在流行病学、临床表现等方面均存在明显的性别差异[1]，女性心血管疾病的临床表现、病理生理和预后与男性不同[2]，这种性别的不同可能部分源于心脏功能强弱的差异[3]。但对单个心肌细胞，较少有研究评价其功能是否也存在性别差异。

收缩力是心肌细胞最具代表性的功能，主要反映心肌细胞发生缩短的内在动力，因其能够对内外源刺激做出反应，可作为预示健康和疾病心肌的重要指标[4-5]。由于单个心肌细胞的收缩与整体心脏功能具有良好的相关性，故对单个心肌细胞施加刺激因素，应用电生理、钙离子成像、细胞力学、免疫组织化学、细胞生物化学等方法对心肌细胞进行观察及定量分析，即可获取对心脏功能的深入了解[4，6]。

Ca2+是连接细胞膜表面动作电位与心肌细胞收缩的重要介质，在兴奋-耦联过程中起关键作用，其浓度变化调节心肌细胞收缩和舒张[7]。在心肌细胞的一个收缩周期中，去极化刺激引起细胞膜L型钙通道开放，少量Ca2+由胞外进入心肌细胞内，触发内质网钙库释放大量的Ca2+，进而引起心肌收缩，这种由心肌细胞膜去极化诱发的细胞内Ca2+浓度瞬时性增高，称为钙瞬变。检测钙瞬变的变化有助于深入了解心肌细胞电活动状态。

在本研究中，我们采用主动脉逆行灌流和胶原酶Ⅱ消化的方法分离成年小鼠心肌细胞，旨在测定并比较不同性别成年小鼠心肌细胞收缩力和钙瞬变，评价性别对成年小鼠心肌细胞功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

8～12周龄C57BL/6小鼠来源于北京大学医学部实验动物中心[实验动物使用许可证号：SYXK(京)2016-0041；实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0010]，体重24～27g，饲养温度(25±2)℃，12 h/12 h明暗交替，所有动物实验遵守北京大学生物医学研究伦理要求。

2，3-丁二酮一肟(BDM)购自Sigma-Aldrich公司；Ⅱ型胶原酶及Fura-2，AM购自Invitrogen公司；细胞收缩及离子浓度同步测量系统购自IonOptix公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心肌细胞的分离 小鼠称重，腹腔内注射肝素(250 U/50 g体重)，20 min后腹腔内注射0.1%戊巴比妥钠(5 ml/kg)进行麻醉。迅速开胸取心脏，将主动脉根部挂于Langendorff 装置，调节灌流液流速至3 ml/min，用含15 mM BDM的台式液灌流3 min，换酶液灌流消化25 min，保持灌流液的温度为37 ℃。待心脏软化后，剪下心室部分，于酶液中剪碎，钝口玻璃吸管轻柔吹打，经80目细胞滤网过滤，除去较大的组织块，500 r/min离心5 min，弃去上清液。按照液体Ca2+浓度0.6 mM-1.2 mM-1.8 mM顺序梯度复钙，即：(1)加入B液，轻柔吹匀后，自然沉降10 min，弃去上清；(2)加入B液、C液等体积预先混匀的液体，轻柔吹匀后，自然沉降10 min，弃去上清；(3)加入C液，轻柔吹匀后，自然沉降10 min。

1.2.2 液体配制 台式液：NaCl(137 mM)、KCl(5.4 mM)、HEPES(20 mM)、MgCl2(1.2 mM)、NaH2PO4·2H2O(1.2 mM)、Glucose(10 mM)、Taurine(10 mM)，用浓度为2 M的NaOH 调节pH值至7.35～7.45，经95%O2、5%CO2氧饱和30 min。酶液：18 mgⅡ型胶原酶(260 IU/mg)，15 mg BSA，22.5 mg BDM，用台式液定容至15 ml。B液：15 mg BSA，用台式液定容至15 ml，加入浓度为1 M的CaCl2母液9 μL，使Ca2+终浓度为 0.6 mM。C液：15 mg BSA，用台式液定容至15 ml，加入浓度为1 M的CaCl2母液27 μL，使Ca2+终浓度为1.8 mM。以上所有液体，均经0.22 μm孔径的滤器过滤后使用。

1.2.3 心肌细胞收缩力和钙瞬变的检测 心肌细胞负载荧光染料 Fura-2，AM，负载浓度为1 μM ，室温避光孵育20 min。向台式液中加入1 M的CaCl2母液使Ca2+终浓度为1.8 mM。弃去上清，加入含1.8 mM Ca2+的台式液轻柔吹打洗涤，室温沉降10 min，弃去上清液，目的是去除残余染料。取一滴细胞悬液上机检测，细胞沉降5 min后，给予10 V、0.5 HZ电场刺激，同时以含1.8 mM Ca2+的台式液灌流，以便及时补充细胞收缩及代谢所需能量和电解质，并去除代谢产物，防止对细胞产生毒性。使心肌细胞稳定至少2 min后，记录心肌细胞肌节长度变化及钙瞬变幅度变化。实验数据用IonWizard 6.2软件分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 两组小鼠心肌细胞形态比较

光学显微镜下观察，杆状细胞约70%～80%，细胞边缘锐利、横纹清晰、折光性好，且复钙后约60～70%的细胞呈静息状态，无自发收缩，提示细胞状态良好。用激光共聚焦显微镜观察并记录细胞形态，比较不同性别成年小鼠心肌细胞，发现其形态外观无明显差别 (图1)。

A：成年雄性C57BL/6小鼠心肌细胞形态；B：成年雌性C57BL/6小鼠心肌细胞形态图1 不同性别C57BL/6成年小鼠心肌细胞形态比较

2.2 两组小鼠心肌细胞收缩力比较

在同样的电场刺激条件下，检测两组小鼠的心肌细胞收缩力，发现成年雄性C57BL/6小鼠心肌细胞肌节缩短幅度[(0.14±0.02)μm比(0.08±0.01)μm，t=2.796，P=0.008](图2)、肌节缩短率(7.47%±0.93% 比 4.60%±0.59%，t=2.608，P=0.0128)均明显高于雌性小鼠。进一步分析发现，给予电刺激后，雄性小鼠心肌细胞最大收缩速度[(-3.25±0.37) μm/s比(-2.11±0.38) μm/s，t=2.163，P=0.0364]及最大舒张速度[(2.45±0.29)μm/s比(1.57±0.31)μm/s，t=2.096，P=0.0421]均高于雌性小鼠心肌细胞。

A：成年雄性小鼠；B：成年雌性小鼠图2 不同性别C57BL/6成年小鼠心肌细胞收缩力比较

2.3 两组小鼠心肌细胞钙瞬变比较

在相同电场刺激条件下，检测不同性别成年C57BL/6小鼠心肌细胞钙信号变化，发现雄性小鼠心肌细胞钙瞬变的峰值[(0.94±0.06)F340/F380值 比(0.77±0.03)F340/F380值，t=2.843，P=0.010]及钙瞬变幅度[(0.25±0.04)F340/F380值 比(0.16±0.03)F340/F380值，t=2.218，P=0.040]均明显高于雌性小鼠(图3)。进一步分析发现，雄性小鼠舒张期钙离子消除时间常数明显小于雌性小鼠[(122.40±22.99)ms比(189.20±19.54)ms，t=2.112，P=0.049]，提示雄性成年小鼠心肌细胞内质网回摄Ca2+的速率大于雌性成年小鼠心肌细胞。

A：成年雄性小鼠；B：成年雌性小鼠图3 两组小鼠心肌细胞钙瞬变比较

3 讨论

性别影响心脏损伤的表现和预后。在给予短时程、大剂量异丙肾上腺素引起的心肌损伤模型中，对于相同的应激损伤刺激，雄性小鼠比雌性小鼠更易发生心肌细胞破裂和心脏肥厚[8]。在临床中，绝经前女性罹患心血管疾病的风险亦显著低于同年龄男性，其临床表现、药物治疗及预后等也不尽相同[9-10]，因此心脏功能有明显的性别差异。然而，目前关于离体单个细胞的功能是否存在差异的报道较少，因此有必要探讨细胞水平的功能是否存在性别差异。本研究比较了不同性别C57BL/6成年小鼠心肌细胞收缩力和钙瞬变，发现成年雄性小鼠心肌细胞收缩力和钙瞬变均高于同年龄的成年雌性小鼠心肌细胞。因此，在基础研究中，不区分小鼠性别将会增大细胞间的差异，需要选用同一性别的小鼠或者选取匹配只数和性别的小鼠分离的心肌细胞。

研究表明，雌激素可通过多种机制影响心肌细胞的电-机械活动。Kravtsov等[11]研究表明，与对照组相比，卵巢切除术后成年大鼠的心肌细胞肌质网兰尼丁受体及钠-钙交换通道活性增加，收缩和舒张能力均增强，而给予雌激素则能够逆转这种改变，表明雌激素能够抑制心肌细胞收缩力，这与本研究结果一致。关于其机制，既往研究显示，雌激素可以下调β1肾上腺素受体(β1AR)的表达并抑制细胞蛋白激酶A的活性，进而抑制下游钙通道的激活，减少Ca2+内流，最终抑制心脏功能[11-12]；此外，心肌细胞收缩力还受肌丝蛋白的转录后修饰、肌丝蛋白对Ca2+的敏感性等多种因素影响[12]。因此，成年雄鼠心肌细胞收缩力高于雌鼠的具体机制仍需进一步研究。此外，Ca2+是心肌细胞最重要的第二信使，在调节心肌收缩、电信号传导及心脏节律中具有重要作用[13]。Fares等[14]研究证实，卵巢切除术后成年C57BL/6小鼠的心肌细胞Ca2+释放幅度较假手术组明显增加；同时，研究发现雌激素能够抑制心肌细胞肌丝对Ca2+的敏感性，表明雌激素能够负调控细胞内钙离子水平[15]，这与本研究中成年雌鼠心肌细胞钙瞬变低于雄鼠的发现类似。Ca2+调节蛋白或离子通道，如受磷蛋白、钙离子-钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、NCX、Ryr、肌浆网钙离子ATP酶等均能对钙瞬变的幅度或者时程进行调控，因此需要进一步探索Ca2+相关调控蛋白及离子通道是否参与调控。

综上所述，本文发现成年雄性C57BL/6小鼠心肌细胞收缩力和钙瞬变高于雌性小鼠。因此，研究中应考虑到性别对成年小鼠心肌细胞功能的影响。

利益冲突：无

参 考 文 献

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