金花普洱茶微生物组成谱的ITS和16sRNA基因文库研究

宁伟泽，徐军

北京市中关村中学，100000

云南的金花普洱作为普洱茶中的珍贵种类，在我国已有千年历史[1]。金花普洱是普洱茶中的极品，用传统工艺制成的普洱茶，除偶尔出现“金花”外，还无法做到人为控制“金花菌”在普洱茶中的增殖。近来以改良工艺制备的“金花普洱紧压茶”是用云南大叶种茶为原料，经二次发酵制作而成，不仅茶多酚含量高，而且外观有大量金色炫目的“金花”点缀，非常独特[2]。“金花”民间称“金花菌”，学名叫“冠突散囊菌”，是对人体有益的酵素类菌，能分泌多种胞外酶催化茶叶化合物的转化，改善茶叶品质，并被认为具有强身健体、消食降脂、降糖抗氧化和防癌抗癌作用，而受到茶叶爱好者和研究者的关注[3]。

近来出现的“金花普洱紧压茶”中点缀的“金花”就是“冠突散囊菌”吗？它的大量增殖会对普洱茶发酵的微生物菌群有何影响？

传统的微生物菌株鉴定和群落结构分析方法主要依靠选择性培养基计数和形态学及生理生化检测，这些研究方法存在分析不完整和鉴定不准确的问题[4]。随着第二代高通量测序手段的成熟，宏基因组分析可以提供丰富数据，从ITS和16sRNA扩增子序列的聚类读取，到全基因组所有结构域分析，允许样本无须培养，直接进行测序分类[5-6]。ITS和16sRNA分别为真菌和细菌核糖体基因中的一部分，它具有种内基因序列相对一致而种间差异较为明显的特征，通过二代测序技术检测，可以特异准确系统全面地分析普洱金花菌紧压茶中是否存在冠突散囊菌，以及其真菌和细菌的组成谱。研究结果不仅有助于推广这一新的制茶工艺，而且将有益于全社会的健康事业。

一、材料与方法

1.样品制备及建库测序

金花普洱茶购于北京五方圣贤文化发展有限公司，5 g茶叶样品用生理盐水过滤，使用真菌DNA提取试剂盒提取对应的DNA。使用PCR扩增和TruSeq试剂盒构建文库，HiSeq2500进行上机测序。

2.数据分析流程

（1）根据Barcode序列从下机数据中拆分出各样品数据。截去Barcode和引物序列后，使用FLASH对每个样品的序列进行拼接。参照Qiime，过滤处理得到高质量的序列。对比数据库Unite da-tabase，检测并去除嵌合体序列。

（2）OTU聚类和物种注释：利用Uparse软件对序列进行聚类，默认以97%相似度将序列聚类成为OTUs（Operational taxonomic units）。比对Unit数据库，对OTUs代表序列进行物种注释，并分别在各个分类水平：phylum（门）、class（纲）、order（目）、family（科）、genus（属）、species（种）统计各样本的群落组成。

（3）香农熵（Shannon entropy）可以评价物种多样性程度，因此用于比较真菌和细菌在茶叶中丰度的多样性。

3.统计分析

ITS和16s测序中香农熵数值比较应用双侧T检验，统计软件为SPSS 17.0.

二、结果与分析

1.ITS测序阐述真菌菌群分布

将金花普洱茶分成3份，每1份茶叶分别提取DNA，进行真菌的ITS二代测序。测序结果如表1所示，金花普洱茶中存在的真菌绝大多数属于子囊菌门 （Ascomycota），散囊菌纲 （Eurotiomycetes），散囊菌目（Eurotiales），发菌科（Trichocomaceae），曲霉属（Aspergillus）。在种水平，其中最高频的OTU1（约99%）分别和4种真菌ITS区完全匹配，这4种真菌分别为：冠突曲霉（Asper⁃gilluscristatus，EF652078），肋状曲霉 （Aspergillus⁃costiformis， HE615136）,谢瓦氏曲霉（Aspergillus⁃chevalieri，EF652068），谢瓦氏曲霉间型变种（As⁃pergillus intermedius，EF652074）。

2.16sRNA测序阐述细菌菌群分布

将金花普洱茶分成3份，每1份茶叶分别提取DNA，进行细菌的16sRNA二代测序。测序结果如图1所示，变型菌门（Proteobacteria）和后壁菌门（Firmicutes）占到了所鉴定菌群的三分之二，是最具有优势的菌门。γ-变型菌纲（Gammaproteobacteria）和杆菌纲（Bacilli）在所鉴定的菌群中占比也超过三分之二，是最具优势的菌纲。但是在细菌目水平，不同样本间菌群构成比差异较大，假单胞菌目（Pseudomonadales）和乳杆菌目（Lactobacillales）是最高频菌目，但是其在不同样本间的比例差异较大，其他菌目比例较低且在不同样本间存在较大差异。在细菌科水平，3个样本最具优势的菌科分别为假单胞菌科（Pseudomonadaceae）、乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae），而且其所占比例在不同样本间差异较大。假单胞菌属（Pseudomo⁃nas）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）、志贺氏菌属（Shi⁃gella）和盐单胞菌属(Halomonas)是最具优势的菌属，但在不同样本中差异较大。

3.细菌和真菌多样性比较

通过分析3份金花普洱茶的16sRNA和ITS测序结果发现，在属水平，细菌和真菌特异属的中位数分别为94和47。为了从整体上评价金花普洱茶的细菌和真菌分布情况，分别计算了金花普洱茶细菌和真菌的香农熵，其中细菌多样性显著高于真菌多样性（P=0.001，双侧T检验）（图2）。

表1 金花普洱茶真菌分布丰度

图1 3份金花普洱茶样品最高频的10种细菌

图2 3份金花普洱茶中细菌和真菌平均香农熵数值比较

三、讨论

本研究首次采用高通量二代测序的方法评价金花普洱茶真菌和细菌组成谱。ITS测序结果显示金花普洱茶富含曲霉属真菌，其他属真菌含量极低。但曲霉属中，最高频的菌种可能为冠突曲霉（As⁃pergilluscristatus，EF652078）、肋状曲霉 （Aspergil⁃luscostiformis， HE615136）、谢瓦氏曲霉 （Aspergil⁃luschevalieri，EF652068）、谢瓦氏曲霉间型变种（As⁃pergillus intermedius，EF652074）中的一种或几种。16sRNA测序结果显示金花普洱茶中假单胞菌属（Pseudomonas）、乳酸菌属（Lactobacillus）、大肠杆菌属（Escherichia-Shigella）和盐单胞菌属（Halomo⁃nas)是最具优势的菌属，但是这几种细菌在不同样本中的比例差异较大，而且金花普洱茶中细菌种类及多样性均显著高于真菌的种类和多样性。

“金花菌”的鉴定一直存在分歧，其中冠突散囊菌在2012年青霉和曲霉国际委员会（ICPA）大会上正式被命名为冠突曲霉[7]。传统的微生物菌株鉴定和群落结构分析方法主要依靠选择性培养基计数和形态学及生理生化检测，这些研究方法存在分析不完整和鉴定不准确的问题[4]。本研究采用高通量二代测序技术检测真菌ITS基因序列，可以客观系统地分析金花普洱茶中真菌组成谱。本研究结果显示，该种方法制作出的金花普洱茶富含曲霉属真菌，但仅靠ITS测序无法最终确定最高频的真菌为冠突曲霉，后续还需联合β‐微管蛋白基因（BenA）、钙调蛋白基因（CaM）及RNA聚合酶II基因（RPB2）序列对上述4种真菌进行全面鉴定。但是由于金花普洱茶中绝大多数为曲霉属真菌，除冠突散囊菌外，其他和冠突散囊菌ITS区测序序列一致的3种真菌不会显著抑制其他真菌的生长，因此金花普洱茶中最高丰度的真菌极有可能为冠突散囊菌。金花普洱茶中真菌组成谱呈现寡克隆性生长模式，曲霉属真菌占据真菌组成谱中的99%，而且真菌物种多样性显著低于相应细菌多样性，这可能是由于冠突散囊菌显著抑制其他属真菌生长造成的。

虽然变形菌纲（Gammaproteobacteria）和杆菌纲（Bacilli）是金花普洱茶中最具优势的菌纲而且占比超过三分之二，但是在目、科和属水平上，金花普洱茶的菌群分布差异较大。

综上所述，金花普洱茶中富含曲霉属真菌，极有可能为冠突散囊菌；同时富含假单胞菌属，乳酸菌属、大肠杆菌属和盐单胞菌属等细菌，其中细菌物种多样性超过真菌。

参考文献

[1]张俊,陈文品,白文祥.普洱茶发展历史三阶段[J].中国茶叶,2004,26(1):35-37.

[2]王丽丽.普洱金花菌紧压茶及制法[J].农村实用技术,2013(2):36-37.

[3]黄婧,杨民和.茯砖茶中“金花”菌的研究进展及应用潜力[J].福建茶叶,2013(1):7-12.

[4]马燕,赵明,周玲,等.普洱茶样中“金花”微生物的分离鉴定[J].茶叶通讯,2011,38(2):17-20.

[5]Hess M,Sczyrba A,Egan R,et al.Metagenomic discovery of biomass-degrading genes and genomes from cow rumen[J].Science,2011,331(6016):463-467.

[6]Qin J,Li R,Raes J,et al.A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J].Nature,2010,464(7285):59-65.

[7]Hubka V,Kolarik M,Kubatova A,et al.Taxonomic revision of Eurotium and transfer of species to Aspergillus[J].Mycologia,2013,105(4):912-937.