丙泊酚对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞p38 MAPK/NF—κB信号通路活性的影响

汪鑫 雷晓文 陈丹 刘斌

[摘要]目的 研究丙泊酚對脂多糖（LPS）诱导的人脐静脉血管内皮细胞（HUBECs）p38 MAPK/NF-κB信号通路活性的影响。方法 将体外培养的HUBECs随机分为4组：对照组（C组）：给予脂肪乳20 mg/L；LPS组（L组）：给予LPS 10 mg/L；丙泊酚组（P组）：给予丙泊酚20 mg/L；丙泊酚+LPS组（PL组）：给予丙泊酚20 mg/L、LPS 10 mg/L。在给予相应药物后1、2、3、6、12 h五个时间点检测p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB含量变化。结果 予以给药1 h时，L组的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分别为10.32±0.73、60.32±5.73，与C组比较表达显著增加（P<0.05）。予以给药2 h时，L组的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分别为9.23±0.53、69.23±5.53，与C组比较，表达显著增加（P<0.05）；PL组的p-p38 MAPK灰度值为6.32±0.35，与L组比较，显著降低（P<0.05）。给药3 h时，L组的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分别为11.13±0.23、71.13±5.23，与C组比较，表达显著增加（P<0.05）；PL组的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分别为8.95±0.21、56.95±5.21，与L组比较，显著降低（P<0.05）。给药6 h时，L组的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分别为12.16±0.20、73.16±4.20，与C组比较，表达显著增加（P<0.05）；PL组的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分别为9.65±0.32、58.65±4.32，与L组比较，显著降低（P<0.05）。给药12 h时，L组的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分别为18.19±0.31、91.19±6.31，与C组比较，表达显著增加（P<0.05），PL组的p-p38 MAPK、NF-κB灰度值分别为12.65±0.12、63.36±5.12，与L组比较，显著降低（P<0.05）。结论 LPS刺激HUBECs能引起p-p38 MAPK、NF-κB表达增加，予以丙泊酚后抑制此种增加，这可能是丙泊酚抗炎的作用机制之一。

[关键词]丙泊酚；人脐静脉内皮细胞；炎症

[中图分类号] R614.2+4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）3（c）-0004-04

[Abstract]Objective To study the influence of Propofol on the activity of p38，MAPK/NF-κ B signal pathway in human umbilical vein endothelial cells （HUBECs） induced by lipopolysaccharide （LPS）.Methods HUBECs cultured in vitro were randomly divided into the 4 groups：control group （group C） was given Intralipid 20 mg/L，LPS group （L group） was given LPS 10 mg/L，Propofol group （P group） was given Propofol 20 mg/L，Propofol+LPS group （PL group） was given Propofol 20 mg/L and LPS 10 mg/L.The change in the content of p38 MAPK，p-p38 MAPK and NF-κB were detected at five time points of 1，2，3，6，and 12 h.Results When administered 1 h，the gray value of p-p38 MAPK and NF-κB in group L was 10.32±0.73，60.32±5.73 respectively，which increased significantly compared with group C （P<0.05）.When administered 2 h，the gray value of p-p38 MAPK and NF-κB in group L was 9.23 ±0.53，69.23±5.53，which increased significantly compared with group C （P<0.05），and the gray value of PL group was 6.32±0.35，which was significantly lower than that of group L.Administration of 3 h，p-p38 MAPK，NF-κB gray value in group L was 11.13±0.23，71.13±5.23 respectively，which increased significantly compared with group C（P<0.05）.p-p38 MAPK，NF-κB gray value was 8.95±0.21，56.95±5.21 respectively in group PL，which decreased significantly compared with group L （P<0.05）.Administration of 6 h，p-p38 MAPK，NF-κB gray value was 12.16±0.20，73.16±4.20 respectively in group L，which increased significantly compared with group C （P<0.05）.p-p38 MAPK，NF-κB gray value was 9.65±0.32，58.65±4.32 respectively in group PL，which decreased significantly compared with the L group （P<0.05）.Administration of 12 h，p-p38 MAPK，NF-κB gray value was 18.19±0.31，91.19±6.31 respectively，which increased significantly compared with group C （P<0.05）.p-p38 MAPK，NF-κB gray value in group PL was 12.65±0.12，63.36±5.12 respectively，which decreased significantly compared with group L （P<0.05）.Conclusion LPS stimulating HUBECs can increase the expression of p-p38 MAPK and NF-κB，and inhibit this increase after Propofol injection may be one of the mechanisms of Propofol anti-inflammation.

[Key words]Propofol；Human umbilical vein endothelial cells；Inflammation

丙泊酚因起效快、作用时间短、可控性好，目前已成为临床广泛使用的一线静脉麻醉药。丙泊酚除了具有镇静麻醉作用外，近年来研究报道[1]丙泊酚可以抗氧化应激，降低组织代谢率，可能对缺血缺氧器官具有保护效应。1992年，O′Donnell等[2]报道，临床剂量范围内的丙泊酚在体外可抑制中性粒细胞的极化，并且此作用与丙泊酚剂量成正相关，自此以后丙泊酚与炎症反应的关系就逐渐被学者们关注并重视。后续有很多研究报道[3-5]，支持丙泊酚的抗炎作用。有研究表明[6]，丙泊酚能抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活、相关炎症因子的释放、NO的生产和细胞结构通透性，但是丙泊酚抗炎作用的具体机制，目前仍不完全清楚。本研究采用体外细胞模型，观察丙泊酚对p38 MAPK磷酸化及NF-κB表达的影响，探讨丙泊酚抗炎的作用机制。

1材料与方法

1.1主要试剂

RPMI 1640培养基（Gibco公司，美国）；肽牛血清FBS（Gibco公司，美国）；新生儿脐带 鼠抗磷酸化p38抗体（CST公司）；兔辣根过氧化物酶偶联二抗（CST；鼠抗p38抗体（CST公司）；鼠抗NF-κB抗体（CST公司）；脂肪乳（Sino-Swed Pharmaceutical Corp.Ltd.，中国）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（Escherichia coli O11：B4，Sigma公司，美国）；化学发光液（Pierce公司，美国）。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 取新鲜人脐带约20 cm长，用预温的D-PBS缓冲液洗去残血，加0.25%的胰蛋白酶于37℃保温10 min，用小牛血清终止反应，并用D-PBS冲洗消化下来的内皮细胞，合并终止液。于室温离心10 min，1000 r/min收集细胞沉淀，用M199细胞培养基悬浮，置于一次性塑料瓶或培养板，37℃，5%CO2，5～7 d可长成。

1.2.2分组处理 取16个6 cm皿处于对数生长期且状态良好的细胞，按照随机方法进行分组。对照组（C组）：给予脂肪乳20 mg/L，LPS组（L组）：给予LPS 10 mg/L；丙泊酚组（P组）：给予丙泊酚20 mg/L；丙泊酚+LPS组（PL组）：同时给予丙泊酚20 mg/l及LPS 10 mg/L。37℃，5%CO2条件下培养 1、2、3、6、12 h后收集细胞悬液，于800 r/min，5 min离心 ，离心半径9.5 cm，棄上清，细胞沉淀中加入适量的细胞裂解液，冰上裂解 30 min，间断置于漩涡振荡器振荡 10 min，4℃离心机中2000 r/min，离心 15 min，离心半径13.5 cm取上清使用 Bradford法定量后置于-80℃冻存。

1.2.3 Western blot检测蛋白表达 取等量蛋白样品上样，以5%的浓缩胶及12%的分离胶行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 电泳（SDS-PAGE），电泳结束后，将凝胶上的蛋白转至大小相同的多聚亚乙烯氧化物（PVDF）膜上。PVDF膜用含 5%脱脂奶粉的洗涤缓冲液 TBST（pH=7.4，TBS中加入 0.1%Tween-20）封闭1 h后，使用TBST缓冲液漂洗3次，把膜放入含有抗 P-p38MAPK（1∶1000）或抗 p-ERK1/2（1∶1000）或抗NF-κB（1∶1000）的一抗稀释液（TBST中加5%胎牛血清）中常温孵育1 h后，4℃孵育过夜。TBST漂洗3次后，用辣根过氧化物酶耦联的二抗（1∶2000）室温下孵育1 h。TBST缓冲液漂洗3次，然后与化学发光液反应1 min，避光显色，加入TBS终止反应。在Kadak digital science ID多功能图像工作站采集结果，分析膜上蛋白条带灰度值。

1.3观察指标

各组在给予相应药物后1、2、3、6、12 h五个时间点检测p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB含量变化。

1.4统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 各组不同时间点p-p38 MAPK表达的比较

与C组比较，L组和PL组在给药后各个时间点的p-p38 MAPK表达增加，PL组较L组降低（P<0.05），P组和C组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

2.2各组不同时间点内皮细胞核NF-κB蛋白表达的比较

与C组比较， L组和PL组在给药后各个时间点的NF-κB蛋白表达增加，PL组较L组增加（P<0.05）（表2）。

3 讨论

血管内皮细胞是人体内重要的效应细胞，其结构和功能的改变在感染性休克、ARDS等的发病过程中起重要作用，也是内毒素等常见的靶细胞[7-8]，同时人脐带静脉内皮细胞来源广泛，因此本研究选取人脐静脉内皮细胞作为研究对象。

LPS是革兰阴性细菌细胞壁的一种成分，其从细菌内释放出来后形成内毒素，可介导严重感染，感染性休克，多器官功能障碍等[9]。有研究报道[10]，通过LPS介导的信号转导通路能为临床治疗内毒素性休克、全身炎症反应综合征提供新的治疗思路。

MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以介导细胞对体内外各种应激的信号反应[11]，p38MAPK是其中一条重要的组成部分。LPS是炎症反应重要的启动因子[12]，它可以激活MAPK家族，使相应蛋白磷酸化而介导炎症反应[13]。

臨床上许多需全身麻醉的手术患者或重症监护室的患者存在全身感染的状态，丙泊酚作为手术室广泛应用的静脉全身麻醉药及ICU镇静药[14-15]，因其具有抗炎作用逐渐受到人们的关注[16-19]。但丙泊酚抗炎作用的具体机制仍不十分明确，因此，本研究以血管内皮细胞为对象，研究丙泊酚在LPS诱导的炎症反应中与MAPK家族磷酸化的关系。

p38MAPK最初被Han等[20]作为一种LPS刺激巨噬细胞中的酪氨酸磷酸化蛋白而鉴定出来。本研究结果显示，与L组比较，PL组各个时间点p-p38MAPK磷酸化水平显著降低，提示丙泊酚抑制炎症反应的作用可能与抑制p38MAPK磷酸化有关。同时，本研究结果显示，与L组比较，PL组在各个时间点的NF-κB蛋白表达含量减低，提示丙泊酚可能通过抑制p38MAPK磷酸化及NF-κB蛋白表达来抑制炎症反应。

综上所述，丙泊酚可以抑制人脐静脉血管内皮细胞受到LPS刺激后p38MAPK磷酸化水平增高，抑制NF-κB蛋白表达，这可能为丙泊酚抑制炎症反应的作用机制之一。但是丙泊酚是否通过改变其他蛋白质的表达，来抑制MAPK蛋白磷酸化和NF-κB蛋白表达仍需进一步研究。

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