12C6+辐射后兵豆根尖细胞染色体形态变异分析

强晓霞，张改相，张志国

（兰州市第四中学，甘肃 兰州 730050）

兵豆（Lens culinaris Medic.）俗称小扁豆，染色体数目2n=14，豆科蝶型花亚科野豌豆族（Vicieae）兵豆属（Lens）双子叶一年生草本植物。兵豆含多种天然活性物质及维生素A、E、K等，营养丰富，食用价值高［1］。兵豆产量较低，辐射育种是选育高产新品种的有效途径［2］。我们使用不同剂量的12C6+离子辐射兵豆干种子，并观察辐射后M1代、M2代根尖细胞染色体形态差异。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试兵豆种子由甘肃省农业科学院作物研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1 辐射处理 将兵豆干种子固定于有机玻璃盘样品盘上，通过机械装置对样品进行旋转。室温条件下，利用兰州重离子加速器装置对干种子进行辐射，加速器的初始能量为80.55 MeV/u的12C6+离子。辐射剂量分别为0（CK）、10、30、60 Gy（gray），其中0 Gy为对照，即不进行种子处理。通过以下公式计算辐射剂量。

D［Gy］=1.6×10-9×LET［keV/um］×F［ions/cm2］×ρ-1［cm3/g］［3］，式中D表示吸收剂量；LET（linear energy transfer）表示传能线密度；F表示单位面积的粒子；ρ表示密度。

1.2.2 种子萌发 将处理后的M1代和M2代种子随机取30粒，放入底部垫有2～3层滤纸的大培养皿中，加入无菌水浸湿滤纸和种子，置25℃光照培养箱中，12 h光照培养，培养5～7 d，每天早晚各加水1次，根尖长1～2 cm时为最佳取样状态。

1.2.3 根尖染色体的取样和观察 切下根尖，长约1 cm，置于卡诺固定液（无水乙醇与冰醋酸的质量比为3∶1）中固定8 h，蒸馏水冲洗干净后置于70%的乙醇中，4℃下保存备用。将固定好的根尖在5 moL/L的HCl溶液中水解3 min，再用1%的混合酶液（1%纤维素酶和1%果胶酶） 水解5 min，取出置载玻片上，滴卡宝品红染色1～2 min，盖好盖玻片压片。光学显微镜下观察根尖分生区的细胞，并计数。

1.2.4 根尖染色体畸变率的计算 不同辐射剂量处理各观察根尖30个，每个根尖随机选择细胞约50个，高倍显微镜下镜检、拍照，计数，统计包括含有染色体桥、微核、滞后染色体、游离染色体等的畸变细胞所占的比例。

图1 12C6+辐射处理兵豆M1代根尖细胞染色体微核与染色体畸变

2 结果与分析

2.1 M1代兵豆根尖细胞核与染色体畸变类型及畸变率

未经辐射处理的兵豆根尖细胞染色体有丝分裂前期、中期、后期和末期，染色体形态均正常（图1 A-D）。经过12C6+辐射处理的M1代兵豆根尖细胞，观察到细胞有丝分裂前期单微核与双微核（图1 E、F箭头表示）。中期染色体断裂，分成两部分（图1 G）；中期滞后染色及染色体断片（图1 H、I），染色体未排列在赤道板中央（图1 J）。有丝分裂后期染色体单桥与染色体双桥（图1 K、L）、染色体桥与微核粘连，后期单微核（图1 M）。分裂期无规则排列的染色体（图1 N）。在M1代根尖细胞中，出现了各种核与染色体畸变类型，如单微核、多微核、染色体桥连、滞后染色体和不均等分裂等。由表1可以看出，M1代根尖细胞中的染色体畸变与微核畸变率，随着辐射剂量的增加而明显增加，在0～60 Gy的辐射强度范围内，60 Gy是最佳辐射剂量，出现各种突变的概率最高。微核一般来源于染色体断片或由细胞核向外突出并延伸而成。微核率和染色体畸变率是检测诱变源的生物效应和遗传效应广泛采用的遗传损失评估指标，微核率及染色体畸变率的高低反映了致突变效应能力的大小，可以快速检测染色体受损程度［4-5］。

表1 M1代兵豆根尖细胞染色体畸形率和微核率①

表2 M2代兵豆根尖细胞染色体畸形率和微核率

2.2 M2代兵豆根尖细胞核与染色体畸变率

观察了兵豆M2代根尖细胞核及染色体形态。在M2代中，这种微核畸变率及染色体畸变率明显减少（表2）。可能是由于辐射后代染色体重组、DNA自身修复等作用，减少了辐射对后代的染色体损伤。但仍然有一部分染色体损伤和变异是不可恢复的，如DNA片段的缺失，碱基增加、颠换、异位及染色体缺失、倒位等，从而造成了后代表型多样性［6-7］。

3 小结

在0～60 Gy重离子12C6+辐射范围之内，辐射诱变能引起兵豆根尖细胞核及染色体形态异常，并随着辐射剂量的增加，微核畸变率及染色体畸变率明显升高。60 Gy剂量辐射出现各种核及染色体变异的概率最高。

参考文献：

［1］MONDAL M M A， PUTEH A B， MALEK M A， et al.Contribution of morpho-physiological traits on yield of lentil （ Lens culinaris Medik L.）［J］.Australian Journal of Crop Science， 2013（ 7）： 1167-1172.

［2］ZHOU W Q， WU Z L， ZHANG Y C， et al.Stable inheritance of excellent agricultural traits induced by12C6+heavy-ions in lentil（ Lens culinaris Medik.） ［J］.Czech Journal of Genetics and Plant Breeding， 2015， 51（ 1）：29-35.

［3］NAGATOMI S， Characteristics of chrysanthemum mutants regenerated from in Vitro explants irradiated with12C5+ion beam［J］.Tokyo Internatinal Exhibition Center，1998， 12： 8-10.

［4］袁成凌，余增亮.低能重离子生物学研究进展［J］.辐射研究与辐射工艺学报，2004，22（1）：1-7.

［5］刘忠祥，徐大鹏，姚泽恩，等.252Cf裂变中子辐射玉米种子生物学效应初步研究［J］.华北农学报，2016， 31（ 5）： 17-77.

［6］SHIKAZONO N， SUZUKI C， KITAMURA S， et al.Analysis of mutations induced by carbon ions in Arabidopsis thaliana［J］.Journal of Experimental Botany，2005， 56： 587-596.

［7］TANAKA A， SHIKAZONO N， HASE Y.Studies on biological effects of ion beams on lethality，molecular nature of mutation， mutation rate， and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants［J］.Journal of Radiation Research， 2010， 51： 223-233.