茶树CsGPX基因克隆及干旱胁迫下的表达分析

乔新荣，张继英

（信阳农林学院，河南信阳464000）

谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，简称GPX）是生物机体内重要的抗氧化酶，它可以清除机体内的H2O2及脂质过氧化物，阻断活性氧自由基对机体的进一步损伤，保护细胞免受氧化胁迫，提高植物的抗逆能力［1－2］。谷胱甘肽过氧化物酶也可以作为信号分子，与激素交联，调节植物的生长发育［3－4］。因此，对谷胱甘肽过氧化物酶进行开发和利用具有重要的意义，现已从烟草、柑橘、拟南芥、大白菜、番茄、豌豆、水稻、龙眼等许多植物中分离和鉴定［5］。

茶树［Camellia sinensis（L.）O.Kuntze］属于山茶科双子叶植物，茶叶具有高效的抗癌、抗衰老、抗辐射、抗氧化、清除人体自由基、降血糖和血脂等一系列药理功能。我国茶区地形分布复杂，包括平原、丘陵、山地和高原。这些地区经常出现季节性干旱、高温、低温等逆境，导致茶芽萌发迟、生长瘦弱，造成茶产量和品质下降。本研究拟克隆茶树CsGPX基因，并对其进行生物信息学方面及干旱胁迫下的转录表达进行初步分析，旨在为今后通过基因工程研究CsGPX基因的表达，探究茶树依赖CsGPX途径清除活性氧的分子基础，以期为鉴定和选育茶树抗逆品种提供分子水平上的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所使用的茶树材料为河南省信阳茶叶示范园区信阳群体种。选取健壮茶树的新梢幼叶，提取总RNA并反转录得到cDNA模板，利用RT－PCR技术克隆CsGPX基因片段。

选取长势一致的茶树健壮植株枝条，于人工气候箱内进行Hoagland完全营养液水培，每3 d更换1次营养液，1周后进行干旱处理。用渗透势为－1.0 MPa的聚乙二醇6000模拟干旱胁迫进行培养，分别收集胁迫 0、3、6、9、12、18、24 h的茶树幼叶，液氮冷冻后保存，分别提取总RNA并反转录得到不同的cDNA模板，利用real－time PCR技术检测CsGPX基因转录表达量。

1.2 试验试剂

DNA分子量标准、Taq DNA聚合酶、dNTPs、克隆载体pMD18－T、DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒、反转录试剂盒，均购自天根生化科技（北京）有限公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq，购自TaKaRa公司；在Primer Premier 5.0中进行引物设计；引物合成及测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.3 引物序列

CsGPX基因克隆引物为F1：5′－GTCAATGTTGCCTCACA ATGTGG－3′，R1：5′－CAGCTTCTTCACGTCCTTCTCAAT－3′。茶树β－Actin基因real－time PCR引物为 F2：5′－AGGGTAT GCTCCTCCTCAT－3′，R2：5′－TCAGCAGTGGTGGTGAACAT－3′。CsGPX基因 real－time PCR引物为 F3：5′－GAGCCAGGG AATAATGAGC－3′，R3：5′－ATTGGAGCAGCATTCTCAC－3′。

1.4 CsGPX基因片段的信息学分析

分别利用 DNAMAN 6.0、Clustal X 1.81及 MEGA 5.2对CsGPX基因片段进行氨基酸序列推断、保守序列分析、进化树构建。

2 结果与分析

2.1 茶树CsGPX基因片段的克隆

根据其他物种GPX基因的保守序列设计特异扩增引物F1和R1，利用Trizol试剂提取茶树幼叶总RNA，检测RNA的质量后，进行反转录获得cDNA第1链，以此为模板，经PCR扩增获得1条大小约为400 bp的目的片段（图1）。反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸50 s，32个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶回收试剂盒将目的片段回收纯化，连接于克隆载体pMD18－T上，热激转化大肠杆菌DH5α。菌落PCR扩增鉴定后，挑取阳性克隆进行测序，经测序克隆到的基因片段长387 bp，利用DNAMAN 6.0软件推断其编码129个氨基酸（图2）。

2.2 茶树CsGPX基因片段的生物信息学分析

从GenBank和PeroxiBase数据库中下载拟南芥（AtGPX 1～AtGPX 8）、杨树（PtGPX 1、2、5、8，PtGPX 6－1、PtGPX6－2）、水稻 （OsGPX1）、玉米 （ZmGPX1）、番茄 （SlGPX）、小 麦（TaGPX）等蛋白质的氨基酸序列，利用 DNAMAN 6.0和Clustal X 1.81软件，与推断的CsGPX基因片段编码的氨基酸序列进行同源性比对。由图3可知，CsGPX编码的氨基酸序列具有GPX蛋白保守特征序列，即具有3个保守结构域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）以及酶活性中心的3个保守的半胱氨酸（C）残基。初步推断其克隆的基因序列是茶树CsGPX基因片段。

利用 MEGA 5.2软件，按 Neighbor－Joining方案对CsGPX及部分植物GPX蛋白的氨基酸序列进行分子系统进化分析，由图4可知，CsGPX保守序列区域与拟南芥AtGPX6、杨树PtGPX6－1、杨树PtGPX6－2等亲缘关系较近。

2.3 CsGPX基因在干旱胁迫下的转录表达分析

使用ABI7300荧光定量PCR仪进行表达量分析，采用20μL反应体系：10μL SYBR Premix Ex Taq，正、反向引物（10μmol／L）各0.5μL，0.4μL ROX Reference Dye（50×），2.0μL cDNA模板，6.6μL ddH2O。反应程序为95℃预变性90 s；PCR反应：95℃ 15 s，60℃ 40 s，共40个循环，每个样品进行3次重复检测，使用2－ΔΔCT法求得待测样品的相对表达量。分别提取干旱胁迫处理 0、3、6、9、12、18、24 h茶树幼叶的RNA，反转录为 cDNA，以此为模板，利用 Primer Premier 5.0设计茶树β－Actin定量PCR引物为F2、R2，CsGPX基因定量PCR引物为F3、R3，以茶树β－Actin片段为内参，检测CsGPX在干旱胁迫下的转录表达量变化。由图5可知，随着干旱胁迫处理时间的延长，相对表达量呈现先升后降的变化趋势，在处理12 h时，CsGPX转录相对表达量达到最大值，约是对照的6倍。随后又降低，24 h后逐渐恢复至处理前的水平。

3 结论与讨论

本研究中克隆茶树CsGPX基因片段所编码的氨基酸序列具有植物GPX的3个特征保守结构域，且含有GPX活性中心的3个保守的半胱氨酸残基，因此，所克隆的CsGPX基因属于植物GPX家族成员。且与已报道的AtGPX6、PtGPX6、TaGPX等亲缘关系较近。初步研究CsGPX的转录表达受干旱胁迫诱导，表明CsGPX参与茶树抗旱信号转导途径。已报道AtGPX6定位于线粒体和胞质，在多种组织的整个发育过程中都高度表达［3］，盐、铁、铝胁迫增强了AtGPX6的mRNA表达水平［6］。利用水杨酸（SA）、生长素（IAA）、脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）等处理后，也引起AtGPX6转录表达量的增加［3］。在AtGPX6基因的启动子区含有ABA、SA、IAA响应元件。另外，定位于小麦叶绿体中的TaGPX基因转入拟南芥超表达后，表现出对盐、H2O2、ABA胁迫的强耐性，且盐、H2O2、ABA信号转导通路中的关键调节子基因（SOS1、RbohD、ABI1／ABI2）的表达水平也在转基因株系中改变［7］。干旱胁迫下水稻的GPX酶活性也增强［8］。这些植物GPX的功能研究为CsGPX的深入研究提供了参考。将来对CsGPX基因的全长进行克隆，将其原核表达，检测其亚细胞定位。也将进一步研究CsGPX酶活性在干旱胁迫中的变化以及其作用底物的特异性，为阐明CsGPX在干旱胁迫信号转导中的作用机制奠定基础。

参考文献：

［1］Mittler R.Oxidative stress，antioxidants and stress tolerance［J］.Trends in Plant Science，2002，7（9）：405－410.

［2］Yang X D，LiW J，Liu JY.Isolation and characterization of a novel PHGPx gene in Raphanus sativus［J］.Biochimica et Biophysica Acta，2005，1728（3）：199－205.

［3］Rodriguez Milla M A，Maurer A，Rodriguez Huete A，et al.Glutathione peroxidase genes in Arabidopsis are ubiquitous and regulated by abiotic stresses through diverse signaling pathways［J］.Plant Journal，2003，36（5）：602－615.

［4］Gaber A，Ogata T，Maruta T，et al.The involvement of Arabidopsis glutathione peroxidase8 in the suppression of oxidative damage in the nucleus and cytosol［J］.Plant＆Cell Physiology，2012，53（9）：1596－1606.

［5］肖 蓉，罗慧珍，张小娟，等.干旱和盐胁迫条件下枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因（ZjGPX）的差异表达及功能分析［J］.中国农业科学，2015，48（14）：2806－2817.

［6］Sugimoto M，Sakamoto W.Putative phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase gene from Arabidopsis thaliana induced by oxidative stress［J］.Genes＆Genetic Systems，1997，72（5）：311－316.

［7］Zhai C Z，Zhao L，Yin L J，et al.Two wheat glutathione peroxidase genes whose products are located in chloroplasts improve salt and H2O2tolerances in Arabidopsis［J］. PLoS One，2013，8（10）：e73989.

［8］Goswami A，Banerjee R，Raha S.Drought resistance in rice seedlings conferred by seed priming：role of the anti－oxidant defense mechanisms［J］.Protoplasma，2013，250（5）：1115－1129.