PINK1介导的线粒体自噬在小鼠皮层神经元氧糖剥夺后表达和意义

王元欣 张磊 黑悦 鱼洋 岳康异 武秀权 蒋晓帆*

(1空军军医大学西京医院神经外科，陕西 西安 710032; 2扶风县人民医院神经外科，陕西 宝鸡 722200)

随着世界老龄化的到来，脑卒中已成了主要“三大杀手”之一[1]。在我国，其中60%～70% 为缺血性脑卒中[2]，给家庭和社会造成了沉重的负担。目前，国内外越来越多的研究关注脑卒中后线粒体自噬的过程和其具体分子机制。自噬体上的标志性蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule related protein-1 light chain-3, LC3)被作为检测的标志性分子；而作为帕金森病相关基因：同源性磷酸酶-张力蛋白诱导的激酶1(PTEN-induced putative kinase protein 1, Pink1)和帕金森蛋白(Parkin)介导线粒体自噬，在缺血性脑卒中中的表达和作用尚不清楚。本研究拟通过培养原代小鼠皮层神经元，采用氧糖剥夺模型，进一步明确线粒体自噬PINK1在不同时长氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation, OGD)后时空表达，为进一步干预奠定实验基础。

材料与方法

一、主要设备和材料

采用怀孕15～16 d的C57BL/6J清洁级孕鼠，购于空军军医大学实验动物中心。超净工作台(Artech)。兔源LC3B一抗、兔源β-Actin一抗(Gene Tex)；兔源PINK1一抗(Abcam)；山羊抗兔IgG/辣根酶标记二抗(中杉金桥)；0.25%胰酶、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、B27 神经元培养添加剂、神经基础培养基(Neurobasal)、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)(Gibco)等。

二、主要方法

1.原代神经元培养：孕鼠颈椎脱臼处死，消毒后取出胎脑，显微镜下剥离胎鼠大脑皮层。虹膜剪剪碎，加入0.25 g/L胰蛋白酶消化液，置于37 ℃孵箱消化15～20 min，每5 min摇晃一次。三支离心管分别加DMEM+20%FBS 8 mL，将消化好的组织用玻璃管分别移至三支离心管来回洗涤，并轻轻吹打，静置5 min后取上层培养液，分别接种于包被过的96孔、24孔、6孔塑料培养板中，4～6 h全量换液，2～3 d半量换液，待神经元成熟做相应处理。

2.体外培养神经元缺血损伤的制作及分组：将神经元培养液换成无糖DMEM培养基，并放置于37 ℃、95%氮气、5%CO2孵箱内2 h、4 h、6 h、8 h，对照组不做任何处理，并在倒置显微镜下观察缺血缺氧后神经元状态。

3.细胞活力测定：96孔板每孔加入20 μL 3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4, 5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3, 5-di-phenytetrazoliumromide, MTT]溶液，在细胞培养箱37 ℃下孵育4 h，吸出孔内培养液后再加入二甲基亚砜溶液，酶标仪在490 nm测定吸光度(optical density, OD)值。以对照组细胞活力为100%，细胞存活率计算用下面的公式：细胞存活率(%) =(OD处理组/OD正常组)×100%。

4.WB检测LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白水平变化：收集各组处理过的神经元，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白后转移到硝酸纤维素膜上，与LC3(1 ∶3 000)、PINK1(1 ∶1 000)、Parkin(1 ∶1 000)、β-Actin(1 ∶3 000)抗体结合，然后与辣根过氧化物酶标记的二抗结合，显色压片后使用扫描仪采集电子图像信息分析。最后以目的蛋白与β-actin的蛋白产物条带灰度值之比作为其蛋白水平的相对量。

5.免疫荧光检测PINK1空间表达：4%多聚甲醛固定20 min，驴血清室温封闭30 min，加入一抗抗体(PINK1 1 ∶1 000)4 ℃过夜，加入驴抗兔荧光二抗抗体(1 ∶1 000)室温孵育3 h，Hoechst染料染核5 min，荧光显微镜观察、摄片。

结 果

一、细胞活力测定

以对照组存活率为100%，OGD 2 h组，细胞活性大幅度下降为64.9%±6.6%；OGD 4 h神经元死亡率相对减少，存活率为54.7%±6.2%；OGD 6 h存活率为36.6%±6.0%；OGD 8 h组大量细胞死亡，存活率仅为31.8%±6.1%。表明不同时长的OGD损伤可造成细胞活性呈进展性下降趋势(P<0.01，图1)。

图1 不同时间ODG处理对小鼠皮层神经元活性的影响

Fig 1 Effect of OGD treatment at different time points of on viability of mouse cortical neurons

aP<0.01,vsOGD 0 h.

二、WB检测OGD后神经元LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin表达

WB结果提示，LC3-Ⅱ在不同时长OGD后，较正常组均有所增高(图2A)，在4 h时达到高峰，随着OGD时长增加，表达下降。至8 h时，与正常组比较，LC3-Ⅱ无统计学差异。PINK1在不同时长OGD后，表达较正常组均有增高，但6 h、8 h较正常组无显著性差异，OGD 4 h与正常组比较有非常显著差异(图2B)。与正常组比较，OGD后Parkin表达呈整体下降趋势，与正常组比较有统计学差异(图2C)。

三、荧光免疫组化检测PINK1表达的结果

Hoechst染色后，正常细胞核均质、圆满，清晰可见。ODG 4 h组，神经元细胞核成波纹状或折缝样，部分细胞核固缩，OGD 8 h组可见大量细胞核裂解为碎块及可见凋亡小体。PINK1在正常神经元包浆中少量均匀分布，与OGD 0 h比较，OGD 4 h组PINK1荧光强度增加，可见大量散在红色强点；OGD 8 h组PINK1包浆结构消失，荧光强度相对减弱。见图3。

图2 WB法检测ODG后不同时间点LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin相对表达量

Fig 2 The relative expression of LC3-Ⅱ, PINK1 and Parkin at different time points after OGD treatment detected by WB

A: Statistical representation for the expression of LC3-Ⅱ; B: Statistical representation for the expression of PINK1; C: Statistical representation for the expression of Parkin.

aP<0.05;bP<0.01,vsOGD 0 h.

图3 荧光显微镜检测氧糖剥夺后不同时间点PINK1的表达(Hoechst, ×400)

Fig 3 Expression of PINK1 in OGD treated mouse cortical neurons at different time points detected by immunofluorescense microscopy (Hoechst, ×400)

A: Fluorescence expression of PINK1 in normal neurons; B: Fluorescence expression of PINK1 after ODG treatment for 4 h; C: Fluorescence expression of PINK1 after ODG treatment for 4 h.

讨 论

最新研究提示，生理情况下，细胞存在低水平自噬，以维持细胞正常代谢及稳态、内环境。而在缺血再灌注损伤的早期，神经元通过自噬消除功能异常的细胞器，减少能量消耗，发挥神经保护作用[3-6]。LC3有4种亚型(LC3-Ⅰ～Ⅳ)，自噬发生时LC3-Ⅱ蛋白聚集于自噬体膜上，其含量与自噬泡数量成正比，可作为检测自噬的标志。正常条件下，PINK1表达较低，在受损或去极化的线粒体上PINK1表达上调，通过其激酶活性，操纵下游的分子改变，促进线粒体自噬[7]，而大量PINK1在受损的线粒体聚集，进而招募Parkin由包浆转位线粒体上，其E3泛素酶被激活，从而介导线粒体自噬[8]。已有研究发现在脑缺血模型中，PINK1具有神经元保护作用[9]，因此，PINK1变化可以评价线粒体自噬的诱导情况。

本实验MTT结果显示，神经元对缺氧敏感，随着缺氧时间的延长，其存活率下降，OGD 2 h后神经元出现大量死亡，与OGD 4 h相比，2 h与4 h的OGD死亡率未成等比例死亡。表明不同时长OGD对神经元存在不同程度损伤。而结果提示LC3-Ⅱ在OGD 4 h表达最高，PINK1也在OGD 4 h时达到峰值，而Parkin蛋白表达水平下降。免疫荧光结果亦表明PINK1在OGD 4 h时荧光表达最强，并大量呈斑点状表达于胞质中。说明在此时，自噬体增加，线粒体自噬增强，大量自噬小体吞噬受损的线粒体。OGD时间越长，损伤程度越严重，细胞形态改变越明显，神经元死亡数量越多。陈璐勔等[10]研究认为，OGD可诱发原代培养小鼠脑皮质神经元自噬发生，且细胞自噬可缓解OGD处理脑皮质神经元的缺血损伤。彭程等[11]通过应用线粒体分裂抑制剂(Mdivi-1)，抑制自噬的发生，从而加重了神经元损伤。因此我们认为，自噬既可以诱导细胞死亡，也可以通过自噬保护细胞，减少细胞的死亡。线粒体自噬的激活可拮抗神经元缺血损伤，损伤4 h内可能是对抗缺血损伤的最佳时机。

脑卒中发生后，时间是紧急救治的关键，同时神经元所处的微环境通过多种微环境影响其存活，作为神经元“能量工厂”的线粒体，其PINK1作为缺血性脑卒中后潜在干预靶点，有待于我们进一步去研究。

参 考 文 献

1GO A S, MOZAFFARIAN D, ROGER V L, et al. Heart disease and stroke statistics-2014 update: a report from the American Heart Association [J]. Circulation, 2014, 129(3): e28-e292.

2DONNAN G A, FISHER M, MACLEOD M, et al. Stroke [J]. Lancet, 2008, 371(9624): 1612-1623.

3BALDUINI W, CARLONI S, BUONOCORE G. Autophagy in hypoxia-ischemia induced brain injury: evidence and speculations [J]. Autophagy, 2009, 5(2): 221-223.

4BALDUINI W, CARLONI S, BUONOCORE G. Autophagy in hypoxia-ischemia induced brain injury [J]. J Matern Fetal Neonatal Med, 2012, 25(Suppl 1): 30-34.

5CARLONI S, BUONOCORE G, BALDUINI W. Protective role of autophagy in neonatal hypoxia-ischemia induced brain injury [J]. Neurobiol Dis, 2008, 32(3): 329-339.

6刘雪, 王枫, 熊利泽. 自噬在急性脑损伤的研究进展 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志, 2017, 16(4): 371-373.

7JIN S M, YOULE R J. PINK1- and parkin-mediated mitophagy at a glance [J]. J Cell Sci, 2012, 125(Pt 4): 795-799.

8NARENDRA D P, JIN S M, TANAKA A, et al. PINK1 is selectively stabilized on impaired mitochondria to activate Parkin [J]. PLoS Biol, 2010, 8(1): e1000298.

9ZHAO Y, CHEN F, CHEN S, et al. The parkinson's disease-associated gene PINK1 protects neurons from ischemic damage by decreasing mitochondrial translocation of the fission promoter Drp1 [J]. J Neurochem, 2013, 127(5): 711-722.

10陈璐勔, 罗艳琳, 赵丽, 等. 细胞自噬缓解氧-糖剥夺诱导原代培养小鼠脑皮质神经元缺血损伤 [J]. 基础医学与临床, 2014,34(12): 1611-1615.

11彭程, 张磊, 饶维, 等. 线粒体分裂抑制剂通过抑制自噬加重OGD/R损伤 [J]. 中华神经外科疾病研究杂志, 2015, 15(2): 101-104.