红掌细菌性疫病病原菌遗传多样性的RAPD和Rep—PCR分析

陈艳梅 高月荣 尹俊梅 牛俊海

摘 要 由地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种引起的细菌性疫病是红掌生产中最具破坏性的病害。本研究对来自全国8个省市主产区的93个红掌细菌性疫病菌株，采用RAPD和Rep-PCR（ERIC、BOX、REP）分子标记进行了遗传多样性分析。筛选出的13个RAPD引物共扩增出131个清晰、重复性好的条带，而Rep-PCR共扩增出65个条带，所有位点多态性比率为100%。基于RAPD和Rep-PCR结果计算的群体遗传距离显著相关，综合2种标记类型的分型结果进行UPGMA聚类分析，表明我国红掌细菌性疫病具有高度的遗传多样性，在遗传相似性系数范围0.519 1～0.984 7，在0.63水平时可以将所有菌株划分为3个组群，分别包括58、28、7个个体，病菌群体的遗传多样性与其寄主品种、地理来源没有明显相关性。本研究为红掌细菌性疫病监测和抗病育种提供了科学依据。

关键词 红掌；细菌性疫病；遗传多样性；RAPD；Rep-PCR

中图分类号 S436.8 文献标识码 A

Abstract Bacterial blight is the most devastating disease of anthurium caused by Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae （Xad）. In this study， ninety-three isolates of Xad from different geographical locations in China were analyzed for genetic diversity using RAPD and Rep-PCR （ERIC， BOX， REP）. A total of 131 clear and reproducible bands were amplified from 13 selected RAPD primers， and 65 bands were amplified by Rep-PCR. The polymorphism rate of all sites was 100%. Based on the fingerprint data， cluster analysis were performed by using the unweighted pair group method， arithmetic average （UPGMA） program， which showed a high genetical diversity among the isolates， with genetic similarity varied from 0.519 1 to 0.984 7. At a similarity of 0.63， all isolates were grouped into three genetic groups （Ⅰ-Ⅲ）， including 58， 28， 7 isolates， respectively. Moreover， no significant correlation between genetic diversity and geographical origin of the isolates. This present data would provide a scientific support for blight monitoring and resistance breeding in anthurium.

Keywords Anthurium； bacterial blight； genetic diversity； RAPD； Rep-PCR

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.020

紅掌（Anthurium andraeanum Lind.）隶属于天南星科Araceae花烛属Anthurium，是一种花、叶兼具观赏价值的重要盆花与切花植物。我国目前已经成为全球最大的盆花产地和消费市场，年产3 000万盆左右，产值大于10亿元。但是，红掌细菌性疫病一直是产业的一大威胁，在我国主要的红掌产区均被发现[1-4]。该病害由地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae （简称Xad） 引起，病原菌主要通过叶片侵染，从叶缘水孔或伤口入侵，造成局部侵染，叶片黄花坏死；后期进入到茎或维管束组织中，堵塞维管束，造成系统侵染，引起叶片脱落，失水死亡[5]。该病害侵染性强、潜伏期长、爆发迅速，比较难以防治[6-7]。

分析病原群体的遗传结构，探寻病原菌遗传分化的多样性，对于认识病害发生传播的因素、危害现状及制定针对性的防治措施，有着积极的指导作用。Khoodoo等[8]对分离自多个国家红掌等植物的25个Xad菌株，进行RAPD遗传变异分析，显示遗传相似性在10%～65%之间，供试菌株可以划分为4个类群。Donahoo等[9]对来自美国佛罗里达、夏威夷等地天南星科植物的Xad菌株基因组DNA进行Rep-PCR（BOX、ERIC、REP-PCR）扩增分型，采用UPGMA法将菌株划分为4个遗传类群，发现遗传聚类和植物物种来源存在一定的相关性。国内，龙那葩[10]采用5对AFLP引物，对采集自浙江省内51个Xad菌株检

测，共扩增出64条多态性条带，遗传聚类在相似性70%上将所有菌株划分为两个类群。付贝等[11]采用Rep-PCR技术对来自广东省主要红掌种植的9个市区27个品种的66个Xad菌株进行遗传多样性分析，结果显示在相似水平为0.85时，可以分为14个遗传组，这表明广东红掌细菌性疫病菌遗传分化明显且具多样性。因此，在红掌细菌性疫病的分子检测、品种抗性鉴定以及红掌种植过程中，要考虑病菌的遗传多样性，以及所导致的致病性分化。

我国红掌商品花销售终端分布全国，而产地仍相对集中在部分省区，且种植户多而分散，带菌种苗、商品花和栽培基质的大范围传播，给病原菌的扩散提供了便利。为了了解我国主要的红掌分布区细菌性疫病菌的遗传概况，本研究室在2010—2014年陆续从全国多地采集，分离、鉴定了93个Xad菌株[12]，本研究在此基础上，采用RAPD 和Rep-PCR对这些代表性菌株进行基因组DNA分型和群体遗传多样性分析，以期了解我国红掌细菌性疫病病原群体现状，为分析成因及有效防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及其来源

供试菌株93个，分别于2010—2014年采自四川、海南、广东、云南、山东、北京、浙江及台湾等8个省市，遍布全国主要的红掌种植区（表1）。病原菌分离纯化后，分别经过致病性接种、16s rRNA基因测序、特异性SCAR或LAMP分子标记检测等，进行了准确鉴定[12]。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取与引物合成 将保存在80 ℃的Xad菌株接入YPGA液体培养基中，28 ℃、220 r/min振荡培养24 h后，用AxyPrepTM Multisource Genomic DNA Miniprep kit （50-prep）提取基因组DNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，并拍照记录。通过超微量分光光度计测定OD值计算其浓度，并用无菌水将其稀释至10 ng/μL，20 ℃保存备用。本研究用已知的黄单胞菌DNA为模板，从17条细菌随机扩增片段多态性（RAPD）通用引物中筛选出条带清晰、重复性好的引物。Rep-PCR引物则使用ERIC、BOX、REP（表2）。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.2 RAPD PCR反应体系Khoodoo等[8]研究的基础上进行优化。PCR总体积为25 μL，其中模板2 μL，10×Bst Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 μmol/L） 0.5 μL，引物（20 μmol/L）1 μL，Mg2+（25 mmol/L） 2.5 μL，Taq 酶（2.5 U/ μl）0.25 μL，ddH2O 16.25 μL。PCR反应条件：预变性94 ℃，2 min；变性94 ℃，40 s；退火35 ℃，1 min；延伸72 ℃，100 s；循环45次；72 ℃，10 min；取7 μL PCR产物于1%琼脂糖电泳，100 V电压，电泳50 min，用凝胶成像系统（Tanon 4100）拍照观察。

1.2.3 Rep-PCR Rep-PCR反应体系总体积为50 μl，包括 1× PCR buffer mix 25 μL、50 pmol/L primer 4 μL、100 ng/μL 基因组 DNA 2 μL、ddH2O 19 μL。利用3个专化寡核苷酸引物。先95 ℃變性7 min； 然后94 ℃变性1 min，退火温度分别为ERIC52 ℃（REP 40 ℃、BOX 53 ℃），65 ℃下延伸8 min，35个循环。65 ℃下再延伸15 min，4 ℃保持。取7 μL PCR产物于1.5%琼脂糖电泳，4 ℃低温、10 v/cm低压慢速2 h，于凝胶成像系统（Tanon 4100）拍照观察。

1.2.4 带型统计及遗传变异评价 用AlphaI?mager 2200对凝胶成像系统所拍的照片进行处理后，统计扩增条带，出现可辨认条带记录为“1”，条带缺失记录为“0”，二元数据中缺失标记为“2”，形成“0/1”电泳图谱，制成EXCEL表格。按照聚类分析软件NTSYS-PC V2.1的格式要求编辑好数据，分别根据RAPD和Rep-PCR的带型统计结果，计算出菌株间的遗传距离矩阵，采用Mantal检测评价不同分子标记遗传分析的相关性。计算出菌株间的地理矩阵，然后通过Mantal检测与遗传距离矩阵的相关性。利用NTSYS-PC V2.1中的SIMQUAL程序计算菌株间相似系数（similarity coefficient），SHAN程序和UPGMA方法进行聚类分析，Treeplot模块建立聚类分析树状图。

2 结果与分析

2.1 Xad病原菌DNA提取与引物筛选

经1%琼脂糖凝胶电泳检测，DNA呈现条带单一，不弥散，OD260/OD280比值在1.7～1.9之间，说明所得的 DNA 纯度较好。检测出 DNA 浓度大多在100 ng/?L以下，浓度较低，但已达到试验要求。从17条细菌随机扩增片段多态性（RAPD）通用引物中，去除条带弥散，重复性差的4条引物（RAPD-01，RAPD-02，RAPD-05，RAPD-49），筛选出13个条带清晰、重复性好的引物。

2.2 Xad病原菌RAPD分析

利用筛选出的13个引物对93个Xad进行RAPD扩增，扩增出的DNA片段大小为500～ 2 000 bp，扩增条带数在6～12条之间，得到131个RAPD位点全为多态性位点，多态性位点频率为100%，所以本研究中Xad的多态性很高（表3，图1）。

2.3 Xad病原菌Rep-PCR分析

在RAPD分析的基础上，为了进一步确定93个Xad的亲缘关系和遗传变异特征，利用Rep-PCR的ERIC、BOX、REP三种引物进行检测。扩增条带数目分别为：ERIC1R 17条， ERIC2 20条， BOXA1R 14条，REP1R-I / REP2-I 14条，总计65条，多态性比率为100%（表3，图1）。由此可见，根据菌株间图谱的差异可以区分供试的不同致病变种。

2.4 Xad 菌株的聚类分析

首先利用NTsys-pc 2.1软件，分别根据RAPD和Rep-PCR的带型统计结果，计算出菌株间的遗传距离矩阵，Mantal检测结果显示存在显著性相关（r=0.549 9，p=0.002），表明2种分子标记类型在多态性位点检测上都有一定的功效（图2）。Mantal检测结果显示遗传距离矩阵与地理距离矩阵不存在显著相关性（r = –0.072 6，p = 0.117 5）（图3）。

为了更全面地评估所有菌株的遗传变异水平，本研究综合RAPD和Rep-PCR两种标记类型的分型结果，对红掌细菌性疫病的93个菌株进行UPGMA聚类分析，并绘制成树状图。结果显示，遗传相似性系数变化幅度较大，分布在0.519 1～ 0.984 7之间，在相似水平63%时，可将93个不同来源的菌株分为3个遗传组（Ⅰ～Ⅲ），分别包括58、28、7个菌株（图4）。其中，遗传组II又可再分为IIA、IIB，分别包括19和9个菌株。

3 讨论

遗传标记在群体中表现的等位基因数量多、位点多态性高，得到的遗传信息才较为可靠。RAPD和Rep-PCR是微生物遗传多样性研究中常用的分子标记类型，两者都具有操作简单快捷、扩增条带丰富、不需要菌种特异性DNA探针等优点。其中，Rep-PCR基于微生物基因组中的高保守区进行扩增，常用的有基因外重复回文因子 （Repetitive Extragenic Palindromic， REP）[13-14]，肠细菌基因间重复一致序列（Enterobacterial Repetitive Inter-genic Consensus，ERIC）[15]和BOX插入因子（BOX1A element）[16]等。开发的Rep-PCR引物扩增产物通常包括5～20条大小在100 bp～5 kb 之间的条带，这类检测技术在微生物的多样性研究中已得到广泛应用[[17-21]。本研究筛选出的13条RAPD引物和Rep-PCR引物分别扩增出131、65个多态性条带，多态性比率均为100%，表明该方法是一种快速而有效的检测方法，能较好地反映出不同菌种间的遗传多样性。RAPD扩增基因组的随机区段，Rep-PCR引物扩增散布的重复序列及其间隔区，Mantal检测显示两类引物检测的群体遗传距离显著相关，表明了分析结果的可靠性，将Rep-PCR和RAPD结合，可以更准确地评价分析病原菌的群体遗传结构。

本研究中使用引物及菌株数量均较前人研究更多，因此得到的结果更具有代表性。与付贝等[11]研究不同，本研究中REP-PCR使用的BOXA1R、REP1R-I/REP2-I引物扩增的Xad，电泳条带多且清晰，可以较好地分辨菌株间的遗传差异。分子检测病原菌可以减少外界影响，更好地反映病原菌的遗传特性。但是，红掌品种以及外界环境的不同影响着病原菌对寄主的作用，不同Xad对不同寄主的致病性还不明晰。因此，分子检测结合病理学鉴定对于不同地区来源的病原菌进行分析，将有助于揭开红掌细菌性疫病的起源、进化和遗传发育关系。

红掌细菌性疫病在我国是一种输入性病害，伴随红掌的引入和扩大栽培，该病害已经广泛传播。从本研究对我国不同疫区菌株的遗传分析结果看，不同个体间和组群间的遗传分化程度都较高，表明虽然该病害在我国的发生不超过30年，但病原菌已经有着高度的遗传变异，即使是在同一地区，乃至同一个红掌种植棚内，都可能分布着不同遗传类型的Xad，前人对浙江省、广东省不同生产区菌株的遗传评价也证实了这一点[10-11]，这可能源于多次输入事件，伴随不同环境条件、管理方式、品种抗性等选择压力下导致遗传分化。UPGMA聚类结果看，有些地理来源相同或接近的遗传相似性程度较高，如源于海南和广东的36个Xad菌株聚为一簇，但一些地理来源较远的菌株也表现出高度的同源性，对其遗传距离和地理距离进行的Mantal检测结果也发现，种群间表现为离散型的点状分布，遗传结构较弱，遗传距离和地理距离没有显著相关，可能的原因是：虽然红掌生产中属于设施栽培、隔离种植，但其组培幼苗、半成品花、商品花等活体植物存在频繁的大范围调运，加快了病原种群间的交流。

过往的研究表明，在天南星科植物中，至少存在两类Xad菌株：（1）源于红掌所在的花烛属植物，除了能够侵染观赏花烛外，还能危害绿萝、万年青、合果芋、龟背竹、白鹤芋等大多数天南星科观赏植物；（2）源于花烛属之外的其他天南星科植物，大多表现为专化性侵染[5]。在基于AFLP、Rep-PCR等分子标记检测研究中，两类菌株在遗传聚类是能被分开[9-10]。本研究因为样本采集的原因，缺乏非花烛属植物来源的Xad菌株，无法和这类遗传类型进行比较。另外，本研究中不同组群菌株的致病力变异水平、及其致病性遗传和分子病理学基础，仍需进一步的研究。

综合以上分析，本研究揭示了我国红掌细菌性疫病菌存在广泛的遗传多样性，并初步划分了种群类型，为病害监测、抗病育种提供了参考。

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