相思树悬浮细胞培养及其细胞形态学观察

林秀莲 叶玲娟 林玉玲 徐小萍 张梓浩 赖钟雄

摘 要 试验分析了基因型、愈伤组织类型、2，4-D浓度、蔗糖浓度，起始接种量等各因素对相思树悬浮细胞培养的影响。结果表明：选择淡黄色，质地鲜嫩松脆的愈伤组织作为相思树悬浮培养的材料，能较快地建立起悬浮细胞系。黑木相思细胞小，胚性强，分散性好，最容易建立起悬浮细胞系。当蔗糖浓度为30 g/L，2，4-D浓度为0.5 mg/L时，适宜于悬浮细胞的保持。起始接种量对相思悬浮细胞系生长也有很大影响，从保持悬浮细胞系的角度看，每瓶25 mL培养基中适宜的接种量为0.5～1.0 g。台湾相思悬浮细胞培养周期以7 d继代1次，卷荚相思悬浮细胞培养周期以8～10 d为宜。同时，通过对悬浮细胞培养的显微观察可以看出不同基因型的相思树悬浮细胞，其细胞生长状态各不相同。

关键词 相思树；悬浮细胞；细胞学观察

中图分类号 S687；Q813.1 文献标识码 A

Abstract The effects of different genotypes， callus types， concentrations of 2，4-D， sucrose concentrations， and inoculation amount on the cell suspension culture were analyzed in the experiment. The results showed that the best initial material of the Acacia spp. for cell suspension culture was the fresh yellow， loose and soft callus II and Ⅲ， which were propitious to establish the suspension cell culture system quickly. In addition， the cells of the A. melanoxylon were small， of strong embryogenic characteristics and fine dispersion， which were easy to establish the cell suspension system. The cell suspension could be maintained well under the conditions that the sucrose concentration was 30 g/L and the 2，4-D concentration was 0.5 mg/L. And the initial inoculation amount also influenced the culture of cell suspension， of which the best inoculation amount was 0.5-1.0 g in 25 mL calli each bottle. The suitable subculture cycle of the cell suspension culture was 7 d in A. confusa， while 8-10 d in A. concinnata. By the histological observation， it showed that there were different cell growth in different genotypes.

Keywords Acacia spp.； cell suspension； histological observation

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.016

相思树是中国引种的重要速生树种，在中国南方短周期工业原料林发展、水土保持和丰富林木种质资源等方面具有重要作用和地位[1]。植物细胞悬浮培养是植物细胞生长的微生物化，由于其分散性好，细胞形状及细胞团大小大致相同，而且生长迅速，重复性好，易于控制等有利因素[2]，因此被广泛用于细胞学、生物化学、生理学、发育生物学、遗传学、分子生物学的研究。悬浮单细胞或小细胞团不仅可直接进行遗传转化、原生质体分离、体细胞杂交等的研究，还可用于生产次生代谢物以及筛选细胞突变体等，因此悬浮细胞已经成为植物生物技术中一个最有用的工具之一[3]。本实验室林珊珊[4]、姬明[5]分別对台湾相思和黑木相思的悬浮细胞系的建立和保持做了研究，叶玲娟[6]研究了相思树的细胞培养及其体胚发生，黄敬文等[7-8]利用黑荆树悬浮细胞进行低 温驯化，Vengadesan等[9]建立了藤金合欢的悬浮细胞系并通过体胚发生方式获得再生植株，Arumugam等[10]利用台湾相思悬浮细胞系进行了诱导子对抗氧剂诱导的影响，Hustache等[11]建立了阿拉伯胶树的悬浮细胞系。同时，Gantait等[12]和Vengadesan等[13]对相思树的组织培养与快繁应用做了比较详细的评述。

本文以台湾相思（Acacia.confusa）、卷荚相思（A. concinnata）及黑木相思（A. melanoxylon）愈伤组织为材料，建立了相思树的悬浮细胞系，比较了愈伤组织类型、不同的2，4-D浓度、不同的蔗糖浓度、不同接种量对相思树悬浮细胞生长的影响。并在此基础上，研究了相思树的悬浮细胞再生愈伤组织及其细胞学观察，以期为相思树遗传转化、细胞突变体筛选等提供优良的试验体系，为苗木快繁、体胚诱导、原生质体分离及有用次生物质生产等方面的研究奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以台湾相思、卷荚相思及黑木相思愈伤组织为材料[4]，由福建农林大学园艺植物生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 不同基因型相思树悬浮细胞系的建立 选取继代培养15 d，鲜重0.5 ～1.0 g，生长旺盛、质地松散的卷荚相思、台湾相思及黑木相思愈伤组织，置于盛有液体培养基25 mL的三角瓶（150 mL）中，用镊子夹碎，而后置于120 r/min的摇床上，在（25± 2） ℃、散射光条件下进行振荡培养，比较3种相思树悬浮细胞系建立过程中悬浮细胞生长情况。

鲜重的测定：取细胞悬浮液，放在已知重量的尼龙网上过滤。过滤后用水冲洗，除去培养基，500 r/min下离心5 min，去除水分，称量后的重量，减去尼龙网（40 μm）重即为悬浮液细胞鲜重。测3次求平均值。

单细胞成活率：在载玻片滴一滴悬浮细胞，用0.4%的伊文思兰染色，被染为蓝色的为死细胞，不被染色的为活细胞，统计一个视野下被染色的活细胞数，统计5个视野求平均值。

1.2.2 愈伤组织类型对相思树悬浮细胞培养系建立的影响 挑选3种相思树不同类型的愈伤组织于悬浮培养液中，分别比较台湾相思白色松软、绿色较硬、鲜黄色松脆的愈伤组织；卷荚相思白色松软、淡黄色松脆的愈伤组织；黑木相思白色絮状、白色松脆的愈伤组织对悬浮细胞系建立的影响。

1.2.3 不同的2，4-D水平对相思树悬浮细胞生长的影響 将3种相思树的愈伤组织0.5 g接到MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA的培养基中附加不同浓度的2，4-D的液体培养基中，2，4-D浓度梯度为：0.05、0.2、0.5、1、2、4 mg/L，统计2，4-D浓度对这3种不同品种相思树悬浮细胞鲜重增长量及单细胞生成率的影响。培养基配制如下：

X1：MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+0.05 mg/L 2，4-D

X2：MS+1 mg/L B A+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L 2，4-D

X3：MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 2，4-D

X4：MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+1 mg/L 2，4-D

X5：MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+2 mg/L 2，4-D

X6：MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+4 mg/L 2，4-D

单细胞生成率的测定：取一滴培养7 d后含相思树悬浮细胞的培养液于载玻片上，在显微镜下观察，测定不同角度的5个视野下单细胞所占的比率，测定3次，求平均值。

1.2.4 不同的蔗糖浓度对相思树悬浮细胞生长的影响 选取已建立的细胞分散、生长旺盛的悬浮细胞系，培养于下面6个培养基（表1），比较不同碳浓度对卷荚相思和台湾相思悬浮细胞培养的单细胞生成率的影响，以及对台湾相思悬浮细胞生长状况的影响。

1.2.5 不同接种量对相思树悬浮细胞培养的影响 分别挑取淡黄色、松散愈伤组织0.1、0.3、0.5、1.0、1.0、2.0、2.5 g于25 mL的液体培养基MS+ 2.0 mg/L BA+1.0 mg/L KT+0.5 mg/L 2，4-D，蔗糖30 g/L中。7 d后观察细胞生长情况。统计悬浮细胞达到最大密度所需的时间、细胞鲜重并计算其增长率。增长率=（培养7 d后细胞鲜重-初始接种量）/初始接种量×100%。测定3次，求平均值。

1.2.6 相思树悬浮细胞生长曲线的绘制 取来源相同的悬浮细胞分成9瓶进行编号，每瓶取鲜重为0.5 g的愈伤组织，加入25 mL的液体培养基进行培养，从培养当天开始，每2 d测定其鲜重。

以上培养基中均添加蔗糖30 g/L，pH值均为5.8，并在1.1 kg/cm2 、121 ℃条件下灭菌20 min。

1.2.7 相思树悬浮细胞系的再生 取继代培养而得3种相思树悬浮细胞系直接滴固体培养基上进行平板培养，观察悬浮细胞愈伤再生情况。

1.2.8 相思树悬浮细胞生长过程细胞学观察 取培养在液体悬浮培养基（培养基为30 g/L蔗糖，MS培养基中添加LH300 mg/L的无激素培养基，pH 5.8）中的悬浮细胞液，滴于载玻片上，放在倒置显微镜下观察悬浮细胞分裂与发育情况，并显微摄影记录。

1.3 培养条件

悬浮细胞培养于HZQ-QX型全温振荡器中，转速120 r/min，光照300 lx，12 h/d。

2 结果与分析

2.1 基因型对相思树细胞悬浮系建立的影响

不同基因型在建立稳定悬浮系的过程中表现不同，其特征差异如表2所示。3种相思树通过方差分析无显著差异。卷荚相思细胞较大，10 d左右就能快速建立细胞分散性好，细胞团由5～10个小细胞组成的悬浮细胞系（图版I-A）。而台湾相思的细胞较小，粘连性强，在继代2周后才能建立起多由10～20个或5～10个小细胞组成的小细胞团的悬浮细胞系（图版I-C）。黑木相思愈伤组织的分散性最强，在悬浮培养液中，细胞立即分散开，能建立良好的悬浮细胞培养液（图版I-B）。通过对悬浮细胞特征的观察还发现，黑木相思细胞分散性最好，形成的细胞悬浮液中，单细胞或小细胞团个数最多，成活率也比较高，但悬浮细胞鲜重的增长量最小。而台湾相思和卷荚相思细胞悬浮液的各项指标都差异不大。

2.2 不同类型愈伤组织对相思树悬浮细胞培养的影响

利用不同类型的愈伤组织进行悬浮培养的结果表明，愈伤组织的形态类型直接影响悬浮细胞的生长状态。对于台湾相思3种形态的愈伤组织来说，白色松软的愈伤组织形成的悬浮细胞系，

细胞形态各异，内含物少；而用绿色坚硬的愈伤组织建立的悬浮细胞系可能由于纤维束分化过多，生长缓慢且不易游离单细胞，难以建立悬浮细胞系。只有色泽鲜黄由致密小颗粒组成的愈伤组织，细胞松散，是台湾相思细胞悬浮培养的好材料。而卷荚相思的愈伤组织，白色松软及淡黄松散的愈伤组织来说，同台湾相思类似，淡黄松散的愈伤组织也是悬浮细胞系建立的最佳材料。同比黑木相思的愈伤组织，其细胞的分散性非常好，愈伤组织均能快速建立起悬浮细胞系。

2.3 2，4-D浓度对相思树愈伤组织悬浮细胞系建立的影响

在悬浮细胞培养中，2，4-D起着十分重要的作用。将台湾相思、卷荚相思、黑木相思3种稳定悬浮系接种到附加不同浓度的2，4-D的液体培养基中培养，3种悬浮细胞系表现出明显的差异性。其结果如图1和图2所示：随着2，4-D浓度的升高，悬浮细胞鲜重都呈先上升后下降趋势。卷荚相思在2，4-D浓度为0.5 mg/L时细胞增殖倍数最大，随后逐渐降低；当浓度达到4 mg/L时，细胞生长明显受抑制，镜检发现空细胞增多。台湾相思和黑木相思悬浮细胞增殖倍数则在2，4-D浓度为1.0 mg/L时最大，随后降低。而相思树悬浮单细胞的成活率则是随着2，4-D浓度的升高而下降。因此，中低浓度的2，4-D水平有利于悬浮细胞系的保持和分化，过高2，4-D浓度不利于稳定悬浮系的建立与保持。因此，本研究选择0.5 mg/L的2，4-D浓度水平来保持相思悬浮系。

2.4 蔗糖浓度对相思树细胞悬浮培养的影响

糖类是植物组织和细胞培养中必要的成分之一，一方面它是植物生长提供所必需的营养成分——碳源，另一方面它作为渗透稳定剂维持细胞生长。本文分别研究了蔗糖浓度为0、15、30、50、70、100 g/L对相思树悬浮细胞生长的影响。其影响结果如图3所示。

由图3可看出，當蔗糖浓度为30 g/L时，卷荚相思和台湾相思分散最好，但随着蔗糖浓度的上升，悬浮产生的单细胞所占的比率逐渐减小。蔗糖对卷荚相思悬浮细胞培养的影响相对较大，当蔗糖浓度达到30 g/L时，卷荚相思单细胞出现接近48%的分离率，而台湾相思出现接近40%的分离率。

从表3可看出，蔗糖为30 g/L时最有利于台湾相思细胞生长，大部分细胞呈圆形，单细胞数目多，细胞碎片少，且细胞生长旺盛，有利于悬浮细胞的保持。蔗糖浓度太高或太低，都容易造成细胞的褐化死亡，且细胞的碎片也增多，细胞多为长条形。这可能是由于如果蔗糖浓度太低，则不足以提供细胞生长足够的养分，造成细胞的死亡；而如果蔗糖浓度太高，则使培养基形成一个高渗透压的环境，不利于细胞对外界营养物质的吸取，从而导致细胞的衰亡。因此，选择30 g/L的蔗糖浓度水平来保持相思悬浮细胞系。

2.5 细胞初始培养密度对相思树悬浮细胞生长的影响

根据不同重量及不同品种的相思树松散愈伤组织转入悬浮培养液中，测定其达到最大密度所需时间、生长量并计算其增殖率，其结果见表4。

由表4可看出，培养密度对相思树悬浮细胞系生长有很大影响，在每瓶25 mL的液体培养基中，当每瓶接种愈伤组织量在0.3 g以上，悬浮细胞才能正常的继代增殖；当接种量小于0.3 g时，悬浮小细胞团或单细胞很难再增殖。当每瓶接种愈伤组织在0.3 g以上时，瓶中悬浮培养生长量随着接种量的增加而增加，达到最大密度所需的时间也随之缩短，而增长率却随之下降，这可能是由于在高密度下培养液中养分消耗殆尽的结果。从表4还可看出，黑木相思悬浮细胞达到最大密度所需的时间最长，而其细胞生长量最少；而卷荚相思悬浮细胞达到最大密度所需的时间最少，其细胞的生长量最大。因此据表分析，卷荚相思和台湾相思悬浮细胞因其生长迅速，可以选择每瓶的接种量在0.3 g；黑木相思悬浮细胞生长缓慢，细胞增殖率小，每瓶接种量可以为0.5 g来保持悬浮细胞系。如果为较快获得悬浮细胞，可将接种量增加至1.5 g左右。

2.6 相思树悬浮细胞生长曲线的绘制

取来源相同的悬浮细胞，每瓶取鲜重为0.5 g的愈伤组织，加入25 mL液体培养基进行培养，从培养当天开始，每2 d测定鲜重，结果见图4。

从图4可以看出，台湾相思、卷荚相思和黑木相思的悬浮细胞生长曲线具有相对一致性。细胞活跃生长期在第4～8天，鲜重迅速增长，细胞表现出强烈的分裂能力。到第8天时，鲜重增加3～4倍；8 d后，培养物鲜重的增长速度明显下降，生长缓慢。同时还可发现，同样的接种量卷荚相思的悬浮细胞增长速度明显比台湾相思和黑木相思快，黑木相思悬浮细胞的增殖量最小。而且卷荚相思和黑木相思悬浮细胞生长的周期也比台湾相思长，在10 d后台湾相思的悬浮细胞生长趋缓，卷荚相思和黑木相思的悬浮细胞系仍保持一定的增长量。所以，台湾相思悬浮细胞培养周期以7 d继代一次比较合适。卷荚相思和黑木相思悬浮细胞培养周期以8～10 d为宜。

2.7 相思树悬浮细胞再生能力测定

选取培养多代后的相思树悬浮培养液5 mL滴于固体培养基上进行培养，5 d后有肉眼可见的台湾相思和卷荚相思小愈伤团出现，20 d后有大量的愈伤组织生成（图版I-E、F、G），而黑木相思悬浮细胞再生速度较慢，10 d左右可见部分小愈伤团，25 d左右才能见愈伤组织大部分长成，生成愈伤组织的量也比台湾相思和卷荚相思少，且有部分胚状体的形成（图版I-D、G）。这说明经过继代多次的相思树悬浮细胞系仍有很强的再生能力，但台湾相思和卷荚相思悬浮细胞再生愈伤能力明显比黑木相思强，这可能是由于黑木相思悬浮细胞较为分散，多由单细胞组成，但有一定胚状体形成能力。而台湾相思和卷荚相思悬浮细胞细胞团含量多，因此再生速度比黑木相思快。

2.8 相思树悬浮细胞生长过程的细胞学观察

将接在液体悬浮培养基MS+BA 1 mg/L+ NAA 0.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L中的相思树悬浮细胞，显微镜下观察发现，3种相思树细胞状态各不相同（图版I）：黑木相思在悬浮培养初期，悬浮培养中大部分为管状细胞，少数为圆形胚性细胞，管状细胞内含物较少，含有较大的淀粉粒，不具有分裂能力，在悬浮培养过程中逐渐死亡（图版I-G、H）。而圆球形的细胞内含物丰富，具有较强分裂能力，在悬浮培养过程中经多次细胞分裂形成许多活力较强的小细胞团和球状的单细胞。经过3～4次继代悬浮培养后，管状细胞逐渐消失，被球状的单细胞和小型不同所替代。而台湾相思和卷荚相思细胞较大，培养初期细胞系主要由一些较大的细胞团组成；由于外部的振荡力及细胞本身的分散力，随着培养时间的延长，细胞系中细胞团变少，游离的单个细胞逐渐增多，这些单细胞个体较大，形状有圆形、长形和不规则形，细胞质分布不均（图版I-I、J）。继续培养细胞发生分裂，由一个细胞来源的多细胞通常粘连在一起形成许多小的细胞团（图版I-K、L）。

3 讨论

3.1 相思树悬浮细胞系建立的关键因素

相思树基因型和愈伤组织类型的选择，是建立悬浮细胞系的关键因素。相思树基因型的不同，细胞大小不一致，对养分、外界环境的感应不一致，使得悬浮培养在各方面均形成较大的差异。黑木相思细胞小，胚性强，分散性好，最容易建立起悬浮细胞系。卷荚相思由于其细胞相对较大，细胞的分散性好，粘连性低，在液体培养基的振荡培养下，细胞结果2次悬浮继代，就可以建立相对分散的悬浮细胞系。同时卷荚相思细胞内含物相对台湾相思少，细胞渗透压底，在高浓度的蔗糖的影响下更容易导致细胞的褐化死亡等现象。

用于建立悬浮细胞系的愈伤组织要求分散性好、增殖快、再生能力强，一般来说其外观呈乳白色或淡黄色， 松散易碎[14-15]。邓素芳等[16]、叶玲娟等[17]已经在朱砂根与相思树等研究表明，由外植体诱导来的愈伤组织往往有多种类型， 选择合适的愈伤组织类型或将已获得的愈伤组织进行巧妙的继代得到松散的胚性愈伤组织至关重要。本试验中选择淡黄色、质地鲜嫩松脆的愈伤组织作为相思树悬浮培养的材料，在培养过程中，本研究也发现这些愈伤组织均能较快地建立起悬浮细胞系，同时，黑木相思愈伤组织还具有较强的胚性能力，因此在悬浮培养过程中就能发现绿色胚状体的形成。而台湾相思和卷荚相思愈伤组织经过悬浮系的选择后，均具有较强的增殖能力。

3.2 影响相思树悬浮细胞生长的主要因素

起始接种密度、蔗糖浓度及2，4-D浓度影响相思树悬浮细胞生长。适宜的起始接种密度，可有效促进细胞的增殖，保持细胞一定的长势，但随着接种量的增加，细胞对养分的需求量也增大，在养分减少的同时，细胞的生长增殖能力也随之下降。赖钟雄等[18]、毛艳萍等[19]、苏齐珍[20]、张云竹等[21]研究均发现适宜的接种密度利于悬浮细胞的生长。本研究发现，卷荚相思和台湾相思悬浮细胞因其生长迅速，可选择每瓶的接种量为0.3 g；黑木相思悬浮细胞生长缓慢，细胞增殖率小，每瓶接种量以0.5 g来保持悬浮细胞系。如果为较快获得悬浮细胞，可将接种量增加至1.5 g左右。

一定的蔗糖浓度有利于悬浮细胞的生长，但是蔗糖浓度太高或太低都会降低悬浮培养中单细胞的分离率，这可能由于高渗透条件减缓了悬浮细胞的生长速度，促进分化而使分散性降低，從而影响悬浮细胞的生长质量，导致细胞内含物的减少，细胞趋向死亡[18]。当培养基中蔗糖浓度太低时，无法满足提供细胞生长的足够的养分，造成细胞的死亡，而在高浓度的蔗糖环境会形成由于高渗透压环境，抑制细胞对培养基中其他营养物质的吸收。这与姬明[5]、李红等[22]、高晗等[23]、赵倩等[24]研究蔗糖对悬浮细胞培养影响的观点一致。本研究发现，30 g/L的蔗糖最有利于相思树悬浮细胞状态的保持。这与赖钟雄等[18]研究龙眼悬浮细胞系中蔗糖对悬浮细胞系的保持是一致的。

2，4-D浓度对愈伤组织悬浮细胞的影响均较明显。不同2，4-D浓度水平，细胞呈不同的状态，过高浓度的2，4-D易导致悬浮细胞褐化、粘连，不利于建立稳定分散的悬浮细胞系。适宜浓度的2，4-D浓度有利于悬浮细胞的增殖及胚性的保持。

3.3 不同种类相思树悬浮细胞生长过程细胞形态学的变化

不同种类（基因型）的相思树悬浮细胞，其细胞生长状态各不相同，通过悬浮细胞组织细胞学观察，本研究可观察到，黑木相思悬浮细胞大小各异，其含有的圆形细胞内含物多且具有很强的分裂能力。而台湾相思和卷荚相思悬浮系细胞多为圆形，但内含物少，呈液泡状，多为小团状。这就使得不同基因型相思悬浮细胞在培养后期分裂的能力和方向不同。黑木相思形成愈伤组织的能力比卷荚相思和台湾相思弱，但黑木相思圆形悬浮细胞内含物多，具有分化能力，能进一步分化成胚状体。

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