转基因番木瓜55—1转化事件定性PCR检测方法的建立

王恒波 肖乃衍 张华 陈平华

摘 要 为了防止国外商业化生产的转基因番木瓜流入国内市场，建立转基因番木瓜55-1转化事件定性PCR检测方法，对于保护国内消费者知情权意义重大。本研究以转基因抗环斑病毒番木瓜55-1为研究材料，利用外源基因和番木瓜基因组序列设计了9对特异性检测引物，通过特异性引物筛选、熔解曲线分析、退火温度优化、特异性验证、灵敏度分析及检测限验证，建立转基因番木瓜55-1转化事件定性PCR检测方法。结果表明：本研究筛选出的检测引物，可特异的检出转基因番木瓜55-1转化事件，引物的检测灵敏度达到了0.1%的标准，高于欧盟0.9%的检测要求，完全可满足转基因检测标识制度的顺利实施。

关键词 番木瓜；转基因；定性PCR；检测

中图分类号 S432.42 文献标识码 A

Abstract Transgenic papaya 55-1， which has been marketed in America for many years， is a genetically modified organism not currently approved for food in China. The paper aimed to establish a qualitative PCR detection method for transgenic papaya line 55-1 and its derivative products for preventing foreign transgenic papaya products into the Chinese market. Based on the exogenous gene and the papaya genome sequence， nine pairs of specific primers were designed with transgenic papaya 55-1 as the research material， using specific primer screening， melting curve analysis and optimization of annealing temperature， specific validation， sensitivity analysis and detection limit verification. The method of transgenic papaya 55-1 and it's derivates was established with qualitative PCR detection. The resulted showed that the screened primers， which could specialize to detect the transgenic papaya line 55-1， could reach 0.1% and the detection sensitivity of primers was higher than the requirements of the detection of EU 0.9%. The method of this paper would provide a scientific and reasonable experiment reference for validating the composition of genetic modified organisms in the future in China.

Keywords papaya； transgenic； qualitative PCR； detection

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.011

番木瓜（Carica papaya L.）又稱木瓜，原产南美洲，现阶段主要分布于热带和亚热带地区。因其果实厚实，果肉甜美可口，同时富含维生素C，其青果中的木瓜蛋白酶可用于医药、食品和化妆品等领域，但是由于番木瓜易受番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus， PRSV）的侵袭，该病害为番木瓜的一种世界性毁灭性病害，一旦植株受到侵染，便很难防治，即使通过清除病株、应用杀虫剂防治昆虫传播病毒措施均很难有效控制病害[1]。我国华南地区田间病害发病率一般都达到30%以上，该病毒会引起番木瓜植株矮缩、叶片斑驳、含糖量降低，使其产业受到严重的威胁，甚至出现绝收[2]。由于番木瓜栽培种中缺乏抗性资源，而野生番木瓜中的抗性基因通过常规杂交育种又很难转入番木瓜栽培种[3]，目前，世界各国育种者通过常规杂交育种方法均未获得满意的抗病品种。1987年美国康奈尔大学、夏威夷大学同Up John公司合作[4]，将PRSV HA5-1株系的外壳蛋白基因转入番木瓜中，培育出对PRSV具有抗性的转基因番木瓜55-1品系，商业名称Sunup和Rainbow[5]，田间实验表现优良。1997年番木瓜55-1通过美国农业部、环保局及食品药品监管局的批准，1998年5月起在夏威夷正式投入商业化生产[6]，这种抗病毒转基因番木瓜极大地振兴了夏威夷的番木瓜产业[7]。因此，将转基因技术应用于番木瓜的研究，对于保障番木瓜产业的健康、可持续发展具有重要意义。

近年来，特别是国内由于食品安全事件层出不穷，引发了广大消费者对转基因生物食品安全的忧虑与担心，为了保护消费者的知情权与选择权，世界上多个国家与地区都对转基因生物食品实施标识管理。加之，由于我国对转基因产品实行强制标识制度，为了标识制度的顺利执行，转基因生物及产品的检测标准的建立也应该紧跟转基因生物产品商业化生产的步伐。目前已经建立转化体特异性检测方法的转基因转化体包括MON810、MON863、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、GA21、MON513、MON1445等[8-15]。

我国对转基因产品实行强制标识制度，但目前为止，全世界获准商业化生产的抗病毒转基因番木瓜有5种（Event 55- 1、Event 63- 1、X17- 2、华农一号、YK系列）。但是针对上述转化事件的检测方法中，对于转基因番木瓜定性PCR检测引物筛选方法未见详细介绍，为了加强对我国政府部门，对市场上流通的番木瓜进行转基因成分进行监测，维护消费者知情权，迫切需要建立适合转基因番木瓜定性PCR检测引物筛选方法。本研究根据GenBank公布的转基因番木瓜55-1所有的转化载体边界序列与番木瓜基因组序列，设计了9对转化事件特异性引物，通过引物特异性、熔解曲线、退火温度、灵敏度等方面进行定性PCR检测。因此，本研究建立的引物的筛选方法，期望为以后其他作物转基因检测体系的建立，提供一个标准引物筛选程序。同时，本研究建立的检测方法适用于含有转基因番木瓜55-1及其衍生产品的检测，为其检测标准的制定提供理论和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 转基因番木瓜55-1种子（由福建农林大学郭晋隆副研究员提供），为了证实该种子的准确性，本研究依据韩建勋等[16]的检测方法，进一步进行验证，PCR产物经过测序、比对发现与GenBank公布的转基因番木瓜55-1序列100%同源。转基因番木瓜55-1含量为5%、1%、0.5%、0.1%的标准品DNA是通过相同含量转基因番木瓜DNA和非转基因番木瓜红妃2号，按质量比（w/w）混合制成，转基因番木瓜16-0-1、“华农一号”、红妃2号（非转基因番木瓜），转基因水稻科丰6号、TT51-1，转基因大豆GTS40-3-2、MON89788、A2704-12、A5547-127和转基因玉米MON810、MON863、NK603、T25、TC1507、Bt11、Bt176、GA21、MIR604、MIR612等19种，为本实验室保存。

1.1.2 试剂和仪器 PCR反应试剂FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）购自厦门鹭隆生物科技有限公司，ExTaq酶、dNTPs、buffer购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司，100 bp Ladder DNA Marker购自天根生化科技（北京）有限公司。Centrifuge 5810R台式离心机（美国），ΜLtrospec2100核酸蛋白分析儀（日本），Mastercycler EP PCR热循环仪（德国），ABI公司7500定量PCR仪（美国），EPS301电泳仪（瑞典），BIO-RAD公司凝胶成像系统（美国）。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据NCBI公布的转基因番木瓜55-1所用的转化载体边界序列与番木瓜基因组序列（GenBank no. FJ467933），采用Primer Premier 5.0软件设计引物。番木瓜内标准基因Papain检测引物采用Wall等[17]设计序列。具体检测引物序列和扩增产物长度见表1。引物稀释成10 ?mol/L备用。

1.2.2 PCR反应体系与程序 定性PCR反应体系25 μL：10×PCR Buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL，引物10 μmol/L各1 μL，ExTaq酶0.125 μL，模板DNA（100 ng/μL）1 μL，加灭菌双蒸水18.875 μL。扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；最后72 ℃延伸7 min后，4 ℃保存备用。电泳时加入6×Loading buffer 1 μL，取6 μL扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。退火温度的优化是在PCR上设置50～60 ℃退火温度范围，取10个温度梯度，分别为50.2、50.7、51.6、52.7、54.0、55.4、56.8、58.1、59.2、60 ℃。

定量PCR反应体系：使用厦门鹭隆生物科技有限公司提供的Roche荧光定量试剂盒，按照说明书进行反应。扩增条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，60 ℃ 40 s，40个循环。熔解曲线温度范围为65.0～95.0 ℃，每间隔0.5 ℃读数一次，每次1 s，连续记录荧光信号的变化，可得到产物的Tm值。每个试样均做3次重复。

1.2.3 定量检测引物熔解曲线分析 本研究按照定量PCR反应程序，将质量百分含量为1%的转基因番木瓜55-1为阳性对照，进行定量PCR扩增，在相同反应条件下，通过9对引物进行相互间比较，分别于起峰时Ct值的大小、熔解曲线及熔解曲线高度等，选择出转基因番木瓜55-1最佳的检测引物。

1.2.4 55-1转化事件特异性PCR检测 以材料中的11种转基因植物（转基因番木瓜YK、转基因番木瓜RP、转基因玉米Bt11、转基因玉米Tc1507、转基因玉米MON810、 转基因玉米MON863、转基因玉米T25、转基因大豆A5547-127、转基因大豆A2704-12、科丰6号、TT51-1水稻）为测试对象，以质量百分含量为1%的转基因番木瓜55-1为阳性对照，非转基因番木瓜红妃2号为阴性对照，并设置空白对照。利用55-1-2引物对进行定性PCR扩增，通过电泳分析PCR产物大小，进而验证转基因番木瓜55-1转化体检测引物的特异性。

1.2.5 55-1转化事件特异性PCR灵敏度检测 将转基因番木瓜55-1 的DNA与非转基因番木瓜DNA溶液（100 ng/μL）按照不同比例混合配成相对含量为5%、1%、0.5%、0.1%的样品，作为PCR检测的模板，进行灵敏度测试，设置空白对照。PCR扩增初始模版浓度定为100 ng/μL，PCR反应体系和PCR扩增程序与1.2.2节相同。

1.2.6 检出限的测试 将质量分数为0.1%的55-1番木瓜样品，提取基因组DNA，进行多次PCR扩增，每次检测设置2个平行PCR反应，PCR反应体系和PCR扩增程序与1.2.2节相同。

2 結果与分析

2.1 番木瓜DNA的质量验证

高质量的DNA是PCR扩增获得成功的前提条件。按照转基因检测标准规定，必须先对番木瓜的内源单拷贝基因Papain进行定性PCR检测，以目的条带扩增产物的有无，来判定提取的DNA是否适合进行PCR扩增，避免假阴性结果的出现。从图1可见，所有样品的PCR扩增产物均能获得与预期片段211 bp相一致，阴性对照与空白对照正常，表明提取的DNA质量满足PCR检测要求。

2.2 引物的鉴定与筛选

为了筛选出最优组合引物对，对55-1外源基因插入位点的左右边界共设计出9对特异性引物，用于扩增外源插入载体和番木瓜基因组连接区域的序列，扩增产物的大小均在200～400 bp之间。开始采用通用的PCR扩增条件，所用扩增模板量一致，扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，获得了实际扩增产物与预期的扩增产物大小一致结果（图2），除了引物对1与引物对3扩增的条带较弱外，其余引物对都扩增出各自预期大小一致的片段，特别是引物对2、引物对6、引物对8扩增条带很亮，说明该引物对扩增效率较高。

2.3 熔解曲线分析

由图3可知，从9对引物各自的熔解曲线分析，只用引物对2与引物对5呈比较典型的单峰曲线，且峰值较高，说明该引物与模板结合性好，PCR扩增效率高，进而扩增产物量多，但是在随后的品系特异性验证过程中发现，引物对5对于非转基因番木瓜有非特异性扩增片段。其余7对引物对都在不同程度上产生双峰，极大地影响了PCR的扩增效率。综合以上实验结果，引物对2不仅特异性强，且PCR扩增效率高，为转基因番木瓜55-1品系特异性检测最适引物对。

2.4 特异性引物退火温度的优化

由图4可知，随着退火温度的逐渐升高，特异性引物能检测出目的条带，没有非特异性条带出现，说明该特异性检测引物适宜的退火温度范围均较广，其中6号泳道（55.4 ℃）扩增产物显示出浓度较高、条带较亮，即通过引物的筛选和反应条件的优化，确定了最适退火温度为56 ℃，该退火温度也是番木瓜内源基因Papain最适退火温度，且两者扩增产物大小比较接近。因此，在实际检测过程中，可将检测内源基因Papain和品系特异性55-1转化事件同时进行。

2.5 转化事件55-1特异性引物55-1-2的PCR特异性检测

本研究选择了多种不同转基因植物品系，涵盖玉米、番木瓜、水稻、大豆等作物，验证转基因番木瓜55-1转化事件检测引物的特异性。检测结果如图5所示，仅从转基因番木瓜55-1品系检测出了275 bp的目的片段，其他参试材料均未扩增出任何片段，这表明本研究建立的番木瓜55-1转化事件检测方法具有良好的特异性和准确性。

2.6 55-1转化事件PCR灵敏度检测

以4种不同相对含量的转基因番木瓜55-1的样品为模板，按照优化后的退火温度56 ℃进行定性PCR扩增（图6）。结果显示，在含量为0.1%以上（含0.1%）的样品中均能稳定扩增到预期DNA片段，表明方法的灵敏度可达到0.1%，完全符合转基因检测的要求。

2.7 检出限的确定

为了进一步测试检测方法的检出限，结果如图7所示。在48次检测中，均能稳定检测出275 bp的预期DNA片段，表明本标准方法的检出限可以稳定达到为0.1%水平。

3 讨论

近年来，随着转基因技术的逐步发展和完善，转基因作物及制品越来越多，其相对应的检测体系和检测方法，尤其是指检测引物更加多样（分为筛选检测引物、基因特异性检测引物、结构特异性检测引物和转化事件特异性检测引物，相应的又分为定性检测和定量检测引物）[18]。如何设计和筛选既适合定性PCR又适合定量PCR引物对，对于检测者来讲需要更高的技术水平。本研究所建立的引物筛选方法，以荧光染料的可视化为基础，首先设计了多对特异性引物，其次是通过引物特异性、熔解曲线、退火温度、灵敏度、检出限等方面进行定性PCR检测，并且层层筛选和验证，最后选择了1对特异性强、扩增效率高的检测引物，该引物不仅适合转基因番木瓜普通的定性PCR检测，而且也适合定量PCR检测。该引物的筛选方法的建立解决了许多转基因作物检测方法仅仅适合定性或定量检测单一检测目的，实现了定性和定量PCR检测引物可以共用的目的，降低了测试成本，提高检测效率。本研究以世界上第一个商业化种植的转基因抗病毒番木瓜55-1为材料，筛选出的引物特异性强、灵敏度高，完全可以达到0.1%的检测阈值，高于欧盟0.9%的标识要求，建立了适合转化事件55-1特异性检测的定性PCR检测方法。

对于常规的转基因检测，一般选择作物的种子为检测对象。因为种子抽样简单，而且易于运输和保存，不容易腐烂、变质。本研究在检测番木瓜种子时，发现番木瓜种子的种皮有黑色物质，且种子坚硬，笔者曾经试图通过研磨种子提取DNA，发现种皮的黑色物质始终存在，即使通过吸附柱过滤，将提取的基因组DNA进行PCR扩增，其中大部分DNA不能扩增出条带，该结果与韩建勋等[16]的研究发现类似。通过浸泡种子后，将黑色种皮剥去，再进行种子研磨，提取番木瓜种子DNA都能满足PCR扩增要求，未发现有PCR抑制物质存在。本研究改良的方法提取番木瓜种子DNA适合进行PCR扩增，不仅纯度高，而且易于操作。

由于定性PCR是终点定量法，无法说明引物的扩增效率，本研究按照SYBR Green 染料法，将1%含量的转基因番木瓜55-1 的DNA样品进行定量PCR扩增，通过熔解曲线性状和峰值大小，来判断引物与模板退火是否适合。如果引物特异性强、扩增效率高， PCR扩增产物量多，溶解曲线的单一，且峰值最高[19]。这种方法常应用在荧光定量PCR的引物筛选中，但是在定性PCR检测引物筛选中未见应用。在随后的品系特异性验证过程中发现，除了引物对55-1-2的特异性强和扩增效率高外，其余引物对都在不同程度上产生双峰，极大降低了PCR的扩增效率，对于将要建立的转基因番木瓜的国家标准而言，该引物对要经得起多种混合DNA干扰扩增出特异性的目标序列。因此，引物对55-1-2为转基因番木瓜55-1转化事件特异性检测最适引物。

综上所述，为了进一步验证本研究建立检测方法的准确性、特异性，通过在福州市各个水果批发市场、大型超市、小型水果商店随机抽样调查，共抽样60个，进行转基因成分检测，检测出的阳性样品都是台湾中兴大学研发的GM-YK系列，由于所有抽检样品产地都是国内生产的番木瓜，未发现国外进口的番木瓜55-1。在随后多次的模拟检测中，本研究建立的定性PCR检测方法具有很高的稳定性，能对转基因番木瓜55-1 进行快速准确的分子鉴定。

参考文献

[1] Manshardt R， Lius S， Sondur S， et al. Papaya breeding for PRV resistance[J]. Acta Horticulturae， 1995（370）： 27-32.

[2] 陈 健. 番木瓜栽培關键技术[M]. 广州： 广东省出版集团， 2004： 242.

[3] 饶雪琴， 李华平. 转基因番木瓜研究进展[J]. 中国生物工程杂志， 2004， 24（6）： 38-42.

[4] Lius S， Manshardt R M， Fitch M M M， et al. Pathogen-derived resistance provides papaya with effective protection against papaya ring spot virus[J]. Molecular Breeding， 1997， 3（3）： 161-168.

[5] Fitch M M， Manshardt R M， Gonsalves D， et al. Transgenic papaya plants from Agrobacterium-mediated transformation of somatic embryos[J]. Plant Cell Reports， 1993， 12（5）： 245-249.

[6] Gonsalves D， Ferreira S， Manshardt R， et al. Transgenic virus resistant papaya： new hopefor controlling papaya ringspot virus in Hawaii[J]. Plant Health Progress， 2000， doi：10.1094/PHP-2000-0621-01-RV.

[7] Suzuki J Y， Tripathi S， Fermín G A， et al. Characterization of insertion sites in rainbow papaya， the first commercialized transgenic fruit crop[J]. Tropical Plant Biology， 2008， 1（3-4）： 293-309.

[8] Berdal K G， Holst-Jensen A. Roundup Ready soybean event-specific real-time quantitative PCR assay and estimation of the practical detection and quantification limits in GMO analyses[J]. European Food Research & Technology， 2001， 213（6）： 432-438.

[9] Nielsen C R， Berdal K G， Holst-Jensen A. Characterisation of the 5′ integration site and development of an event-specific real-time PCR assay for NK603 maize from a

low starting copy number[J]. European Food Research & Technology， 2004， 219（4）： 421-427.

[10] Hernández M， Esteve T， Prat S， et al. Development of real-time PCR systems based on SYBR Green I， Amplifluor? and TaqMan technologies for specific quantitative detection of the transgenic maize event GA21[J]. Journal of Cereal Science， 2004， 39（1）： 99-107.

[11] Hernández M， Pla M， Esteve T， et al. A Specific real-time quantitative PCR detection system for event MON810 in maize yield gard based on the 3′-transgene integration sequence[J]. Transgenic Research， 2003， 12（2）： 179-189.

[12] Huang H Y， Pan T M. Detection of genetically modified maize MON810 and NK603 by multiplex and real-time polymerase chain reaction methods[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2004， 52（11）： 3 264-3 268.

[13] Pan A， Yang L， Xu S， et al. Event-specific qualitative and quantitative PCR detection of MON863 maize based upon the 3?-transgene integration sequence[J]. Journal of Cereal Science， 2006， 43（2）： 250-257.

[14] Taverniers I， Windels P， Va?tilingom M， et al. Event-specific plasmid standards and real-time PCR methods for transgenic Bt11， Bt176， and GA21 maize and transgenic GT73 canola[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2005， 53（8）： 3 041-3 052.

[15] Yang L， Xu S， Pan A， et al. Event specific qualitative and quantitative polymerase chain reaction detection of genetically modified MON863 maize based on the 5'-transgene integration sequence[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2005， 53（24）： 9 312-9 318.

[16] 韓建勋， 陈红运， 邓婷婷， 等. 抗病毒转基因番木瓜的实时PCR检测[J]. 检验检疫学刊， 2010， 20（1）： 15-20.

[17] Wall E M， Lawrence T S， Green M J， et al. Detection and identification of transgenic virus resistant papaya and squash by multiplex PCR[J]. European Food Research & Technology， 2004， 219（1）： 90-96.

[18] 张 丽， 武玉花， 吴 刚， 等. 转基因油菜筛查检测策略研究[J]. 中国油料作物学报， 2012， 34（1）： 74-81.

[19] 陈如敬， 黄秋宇， 修金生， 等. 猪细环病毒k2型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立[J]. 中国动物传染病学报， 2016（5）： 10-15.