油菜素类固醇对扇叶铁线蕨配子体生长的影响

汪金梅 于旭东 蔡泽坪 徐诗涛 罗佳佳 杨紫薇

摘 要 以扇叶铁线蕨（Adiantum flabellulatum L.）孢子为实验材料，通过不同浓度2，4表油菜素内酯（2，4-epibrassinolide，2，4-eBL）处理，观察孢子萌发及原叶体的生长状况。结果表明：10–10 mol/L 2，4-eBL促进扇叶铁线蕨孢子萌发，10–11 mol/L 2，4-eBL促进原叶体生长。本实研究不仅为促进扇叶铁线蕨孢子萌发和原叶体生长提供新方法，而且还为研究植物激素调控蕨类植物生长提供参考。

关键词 油菜素类固醇；扇叶铁线蕨；配子体；孢子萌发

中图分类号 Q949.9 文献标识码 A

Abstract The spores of Adiantum flabellulatum L. were treated with different concentrations of 2，4-epibrassinolide to observe the spore germination and the growth of the gametophyte. The results showed that 10–10 mol/L 2，4-eBL could shorten the spore germination， and 10–11 mol/L 2，4-eBL could promote the growth of the gametophyte. This experiment would not only provide new ways to promote the spore germination and gametophyte growth of A. flabellulatum， but also provide references for the study of phytohormones in the regulation of the growth of ferns.

Keywords brassinosteroids； Adiantum flabellulatum L.； gametophyte； spore germination

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.009

油菜素类固醇（Brassinosteroids， BRs），是一类天然的植物激素，广泛存在于植物的花粉、种子、茎、叶等器官中[1-2]，其能提高植物的抗逆性，在种子萌发、营养生长及生殖生长等诸多方面都有调控作用[3-5]。在油菜素类固醇对植物的生理作用研究中，以拟南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）、水稻（Oryza sativa L.）、豌豆（Pisum sativum L.）和番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）等較为深入[6-8]；然而，关于BRs在蕨类植物中的作用知之甚少，仅在欧洲蕨（Pteridium aquilinum （L.） Kuhn）、紫萁（Osmunda japonica Thunb.）、问荆（Equisetum arvense L.）等少数物种中有研究报道[9-10]。

扇叶铁线蕨（Adiantum flabellulatum L.）具有良好的观赏价值及药用价值，在医疗卫生及园林设计中均有应用。国内外诸多学者研究了各类植物激素对其生长发育过程的影响，如高浓度2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）会抑制其原叶体增殖，吲哚丁酸（IBA）使原叶体只进行营养增殖而不进行有性生殖，萘乙酸（NAA）促进绿色球状体（GGB）增值与分化等[11-13]；然而关于BRs对扇叶铁线蕨生长的影响还未见报道。本研究以扇叶铁线蕨孢子为实验材料，探究不同浓度的2，4表油菜素内酯（2，4-epibrassinolide，2，4-eBL）对其孢子萌发及原叶体生长的影响，不仅为促进扇叶铁线蕨孢子萌发和原叶体生长提供新方法，而且还为研究植物激素调控蕨类植物生长提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

扇叶铁线蕨孢子采自海南儋州橡胶林。将具有成熟孢子的叶片采下，用手轻轻揉搓孢子囊，将脱落下的孢子收集于干燥密闭容器中，于4 ℃低温保存。

1.2 方法

1.2.1 2，4-eBL对扇叶铁线蕨孢子萌发时间的影响 将新采摘的孢子及常温贮藏2个月的孢子分别用无纺布包裹后，用75%乙醇浸泡30 s，再用75%乙醇和0.1%升汞1：9混合液消毒4 min，最后用无菌水冲洗4～5遍[12-14]。在超净工作台上，将消毒孢子接入2，4-eBL浓度分别为0、10–13、10–12、10–11、10–10、10–9、10–8、10–7、10–6 mol/L的1/4 MS培养基中培养[15-17]。自接种6 d起，每天用显微镜观察各浓度下孢子是否萌发。

1.2.2 2，4-eBL对扇叶铁线蕨孢子萌发率的影响 将常温贮藏2个月的孢子消毒后接入2，4-eBL浓度分别为0、10–13、10–12、10–11、10–10、10–9、10–8、10–7、10–6 mol/L的1/4 MS培养基中培养。接种后第20天，统计各浓度梯度下培养瓶中的孢子数量及萌发数量。

1.2.3 2，4-eBL对扇叶铁线蕨原叶体生长的影响 把消毒后的孢子接入1/4 MS培养基中，培养60 d后，将得到的无菌原叶体继代于2，4-eBL浓度分别为0、10–12、10–11、10–10、10–9、10–8、10–7、10–6 mol/L的1/4MS培养基中。继代培养20、40 d后，测量各浓度下的原叶体大小及原叶体细胞 大小。

1.2.4 培养条件 温度为（24±2） ℃，光强为20 μmol/（m2·s），光照16 h/d，黑暗8 h/d。培养基消毒前调pH 6.0，每组处理设置8个重复，每个重复8个样品。

1.3 数据统计分析

向每个培养瓶中加入500 ?L蒸馏水，将培养基上的孢子充分洗脱得到孢子悬浊液，吸取60 ?L孢子悬浊液在显微镜下进行计数。扇叶 铁线蕨孢子萌发率=孢子萌发数量/孢子总 数量×100%；原叶体大小采用Image J软件测 量；用u检验进行实验组与对照组的显著性 分析。

2 结果与分析

2.1 2，4-eBL对扇叶铁线蕨孢子萌发时间的 影响

常温贮藏2个月的孢子于接种后第8天开始萌发，最先萌发的2，4-eBL浓度为10–10 mol/L，接种第10天各浓度梯度下的孢子均有萌发。新鲜孢子萌发较贮藏2个月的孢子萌发晚，于接种后第12天开始萌发，最先萌发的2，4-eBL浓度也为10–10 mol/L，接种第15天各浓度梯度下的孢子均萌发。由此可见，10–10 mol/L 2，4-eBL利于扇葉铁线蕨孢子萌发，最短萌发时间为8 d；且常温贮藏2个月的扇叶铁线蕨孢子比新鲜孢子先萌发4～ 5 d。

2.2 2，4-eBL对扇叶铁线蕨孢子萌发率的影响

外源施加2，4-eBL能促进扇叶铁线蕨孢子萌发。由表1可知，无2，4-eBL的情况下接种第20天孢子萌发率为4.47%，10–10 mol/L 2，4-eBL处理的扇叶铁线蕨孢子萌发率最高，达29.65%；当浓度高于10–10 mol/L时，促进效果逐渐减弱。

2.3 2，4-eBL对扇叶铁线蕨原叶体生长的 影响

低浓度2，4-eBL能促进扇叶铁线蕨原叶体生长，高浓度则产生抑制作用。继代20 d，不添加2，4-eBL，原叶体高度和直径分别为4.20、5.20 mm，施加10–11 mol/L 2，4-eBL，原叶体生长效果最佳，高度和直径分别为5.74、5.53 mm，是对照的1.15、1.10倍（表2，图1）；且该浓度下细胞面积也最大，达7 000.73 μm2，为对照组的1.15倍（表3，图2）。继代40 d，以10–10 mol/L 2，4-eBL处理效果较好，原叶体高度、直径及细胞面积分别为8.05 mm、10.57 mm、8 939.99 μm2，分别为对照的1.02、1.13、1.36倍（表4，表5）；而高浓度2，4-eBL在原叶体生长期间则产生明显的抑制作用（图3，图4）。

2.4 高浓度2，4-eBL对扇叶铁线蕨原叶体生长的褐化作用

当2，4-eBL浓度高于10–8 mol/L时，继代培养40 d的扇叶铁线蕨原叶体出现褐化现象，褐化率为21.3%；随着2，4-eBL浓度的增加，褐化作用越加明显，当2，4-eBL浓度为10–6 mol/L时，褐化率高达38.3%（表6）。显微观察发现，褐 化现象最初出现在单个细胞中，继而向四周的 细胞扩散，褐化率较高时可使整个原叶体死亡（图5）。

3 讨论

各学者研究得出的孢子萌发时间从4 d到2个月不等[13， 18]。导致研究结果产生较大差异的原因可能是孢子采收的成熟度及贮藏时间和方式的不同。本研究利用成熟孢子，发现2，4-eBL能缩短扇叶铁线蕨孢子萌发时间，10–10 mol/L 2，4-eBL处理的孢子萌发仅需8 d，接种20 d萌发率达29.65%。本研究还发现，常温贮藏2个月的孢子比新鲜孢子先萌发，推测常温贮藏可能促进孢子后熟。

低浓度2，4-eBL利于扇叶铁线蕨原叶体生长发育，生长初期以10–10 mol/L最佳，后期以10–10、10–9 mol/L较为适宜，高浓度则产生明显的抑制作用。原叶体细胞面积测量结果显示，原叶体体积较大时，相应的细胞面积也较大，由此推测2，4-eBL对原叶体生长的影响可能是由调控细胞大小所致。BRs具有很高的生理活性，但综合实验结果发现，BRs对扇叶铁线蕨孢子萌发及原叶体生长的影响也表现为低浓度促进高浓度抑制。

当2，4-eBL浓度高于10–7 mol/L时，继代培养40 d的扇叶铁线蕨原叶体出现明显的褐化作用，随着BRs浓度的增加，褐化率也随之增长。显微观察发现，褐化现象最初出现在单个细胞中，继而向四周的细胞扩散；褐化率过高时可使整个原叶体死亡。产生褐化现象的原因可能是BRs能提高多酚氧化酶的活性或者促进酚类化合物的形成，具体原因还有待更深入的研究[19-20]。

参考文献

[1] 侯雷平， 李梅兰. 油菜素内酯（BR）促进植物生长机理研究进展[J]. 植物学报， 2001， 18（5）： 560-566.

[2] 杨鑫鑫， 潘秋红. 油菜素甾醇分析方法概述及其在果实中的应用[J]. 热带生物学报， 2016， 7（1）： 139-146.

[3] 王红红， 李凯荣， 侯华伟. 油菜素内酯提高植物抗逆性的研究进展[J]. 干旱地区农业研究， 2005， 23（3）： 213-219.

[4] 靳开川， 何金环. 油菜素内酯在植物抗逆中的作用及信号传导机制综述[J]. 江苏农业科学， 2017， 45（14）： 4-7.

[5] Yokota T， Ohnishi T， Shibata K， et al. Occurrence of brassinosteroids in non-flowering land plants， liverwort， moss， lycophyte and fern[J]. Phytochemistry， 2017， 136： 46-55.

[6] 华智锐， 李小玲. 油菜素内酯对小麦幼苗抗旱性的诱导效应[J]. 江苏农业科学， 2017， 45（1）： 62-65.

[7] Hirano K， Yoshida H， Aya1 K， et al. Small organ size 1 and small organ size 2/dwarf and low-tillering form a complex to integrate auxin and brassinosteroid signaling in rice[J]. Molecular Plant， 2017， 4（10）： 590-604.

[8] 毛玉娇. 干旱胁迫下油菜素内酯对番茄幼苗生长的影响[D]. 咸阳： 西北农林科技大学， 2016.

[9] 范鹏丽， 孙晓霞， 吴 光， 等. 紫萁油菜素内酯受体cDNA的克隆及其进化分析[J]. 生命科学研究， 2015， 19（4）： 310-315.

[10] Inoue S， Iwashita N， Takahashi Y， et al. Brassinosteroid involvement in Arabidopsis thaliana stomatal opening[J]. Plant and Cell Physiology， 2017， 58（6）： 1 048-1 058.

[11] Wu H， Yuan L P， Wang Y， et al. Studies on in vitro culture of Adiantum flabellulatum from spores[J]. Acta HorticulturaeSinica， 2010， 37（3）： 457-464.

[12] Chen C. Tissue Culture and Regeneration of Adiantum flabellulatum[J]. Journal of Fujian Forestry Science & Technology， 2011， 38（4）： 65-68.

[13] 王 洋. 扇叶铁线蕨孢子离体培养及其快繁体系的建立[D]. 武汉： 华中农业大学， 2008.

[14] 李 静， 夏桂春， 龚 慧， 等. 狭眼凤尾蕨的形态发生及组织培养[J]. 热带作物学报， 2008， 29（5）： 626-631.

[15] Szekeres M， Németh K， Mathur J， et al. Brassinosteroids rescue the deficiency of CYP90， a cytochrome P450， controlling cell elongation and de-etiolation in Arabidopsis[J]. Cell， 1996， 85（2）： 171-182.

[16] Sharma P， Kumar A， Bhardwaj R. Plant steroidal hormone epibrassinolide regulate-Heavy metal stress tolerance in Oryza sativa L. by modulating antioxidant defense expression[J]. Environmental & Experimental Botany， 2016， 122： 1-9.

[17] Li J， Nagpal P， Vitart V， et al. A role for brassinosteroids in light-dependent development of Arabidopsis[J]. Science， 1996， 272（5 260）： 398-401.

[18] Cao J G， Huang W J， Wang Q X. Microstructural observation on the development of gametophytes and oogenesis in the fern Adiantum flabellulatum L.[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica， 2010， 30（4）： 702-707.

[19] Creasy L L. The increase in phenylalanine ammonia-lyase activity in strawberry leaf disks and its correlation with flavonoid synthesis[J]. Phytochemistry， 1968， 7（3）： 441-446.

[20] 王 棟， 买合木提·克衣木， 玉永雄， 等. 植物组织培养中的褐化现象及其防止措施[J]. 黑龙江农业科学， 2008， 8（1）： 7-10.