闽楠溃疡病病原鉴定及其生物学特性研究

郭朦朦　陈全助　冯丽贞　杨泽慧　陆芝　冯锦秀　黄捷

摘 要 闽楠（Phoebe bournei），我国Ⅱ级保护濒危植物，是亚热带常绿阔叶林重要组成树种，而闽楠溃疡病的发生严重危害其开发利用。为明确闽楠溃疡病的致病菌，以便后续科学的指导病害防治，本文从福建省闽楠病枝中分离纯化菌株，通过致病性测定、形态学观测以及rDNA-ITS、GAPDH、β-tubulin、Histone3序列分析鉴定病原菌，并分析其生物学特性。结果显示：从闽楠病枝中分离出4种菌株，分别编号为SS-01、SS-02、SS-03和SS-04，其中菌株SS-03致病菌为粉红粘帚霉（Clonostachys rosea Schroers， et al.=Gliocladium roseum Bainier）；该菌菌丝在PDA+PBL培养基（pH 6.0）上25 ℃黑暗条件下生长最好；最适菌丝生长碳源为麦芽糖，可溶性淀粉有利于产孢；最适氮源为牛肉浸膏；产孢量在PDA培养基（pH 7.0）上25 ℃全黑暗条件最高。空气相对湿度≥90%（pH 8.0）时孢子萌发率最高。高温高湿以及高郁闭度易于闽楠溃疡病发生，故在营林造林以及苗圃抚育时应注意通风透气，控制温湿度，防止病害发生。该研究结果为科学有效地指导闽楠溃疡病防治提供技术支持。

关键词 闽楠；溃疡病；病原鑒定；粉红粘帚霉菌；形态学特征

中图分类号 S792.24 文献标识码 A

Abstract Phoebe bournei was listed as the second-class important native plants in China. It is an important component of subtropical evergreen broad-leaved forest. But the occurrence of stem canker seriously affects its development and utilization. In order to understand its pathogens and to scientifically prevent the disease， the morphological characteristics identification， rDNA-ITS， GAPDH、β-tubulin， Histone3 genes sequences analysis of 4 different strains from the P. bournei cankered stems， named as SS-01， SS-02， SS-03 and SS-04 were studied. S-03 was indentified as Clonostachys rosea Schroers， et al.=Gliocladium roseum Bainier. The optimal conditions for the mycelium growth was PDA+PBL medium with pH 6.0 cultivated at 25 ℃ in dark. The best carbon source for mycelium growth was maltose， while the best for sporulation was soluble starch. The best nitrogen source for both mycelium growth and sporulation was beef extract. The suitable conditions for spore production was PDA medium with pH 7.0 cultivated at 25 ℃ in dark.The relative humidity was equal or greater than 90% with pH 8.0 and cultivated at 25 ℃ in dark had the highest spore germination. High temperature， high humidity and high canopy density were easy to induce P. bournei stem canker， so it is necessary to pay attention to ventilation， have temperature and humidity controlled to prevent the occurrence of the disease in forest planting and nursing The results provide a technical support for scientific and effective prevention and control of P. bournei stem canker.

Keywords Phoebe bournei； stem canker； identification； Clonostachys rosea； morphological characteristics

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.020

闽楠（Phoebe bournei）系樟科（Lauraceae）楠属（Phoebe）常绿大乔木，是我国特有用材树种，因其材质通直、纹理精美、并带有特殊香味，广泛用于家具、建筑、雕刻行业[1-7]。闽楠树姿优美，冠大荫浓，具有净化空气、隔音降噪、杀菌驱虫等生态功能，也是优良的园林绿化树种[5-7]。 故闽楠素有“中华第一树”的美称[4]，古往今来备受人们的青睐，导致闽楠天然林资源被掠夺式采伐。同时闽楠人工林规模小、自身繁殖率低下、自然更新周期长等内在因素，使闽楠资源日趋衰竭[7-9]，现已列为国家二级濒危保护植物[1-2]，闽楠林的保护已经迫在眉睫。然而，随着人工纯林的规模化发展，闽楠病害日趋严重。2015年，福建各楠木种植区相继发现有闽楠病害危害，之后课题组成员随福建省林业厅森林检验检疫局对福鼎、建阳、顺昌、明溪县等闽楠溃疡病受害区进行实地调查，发现受害林分发病率高达100%，严重时造成植株枯死，经济损失惨重。

有研究表明粘帚霉属（Clonostachys）可作为植物病害病原菌造成枸杞（Lycium barbarum）、蚕豆（Vicia faba L.）、黄豆（Glycine max）和紫花苜蓿（Medicago sativa）以及仙人掌（Pachycereus pringlei）的根腐，梨（Pyrus spp.）、龙眼（Dimocarp us longan Lour）的烂果[10-15]。还有不少研究表明，粉红粘帚霉具有生防作用[16-21]，但其在闽楠上的危害却未见报道。有鉴于此，本文对福建省闽楠种植区采集的闽楠溃疡病病原进行分离，在形态学观察和分子生物学鉴定的基础上，研究其生物学特性，旨在为闽楠溃疡病的科学防治提供技术支持，解决目前闽楠大面积人工栽培所遇到的障碍，促进闽楠产业可持续发展。

1 材料与方法

1.1 标本采集及预处理

2016年7月自福建南平建阳和宁德福鼎县闽楠天然林、人工林采集具有典型溃疡病症状的闽楠枝干，切取病健交界处2 mm×2 mm大小组织，经75%酒精、0.1%升汞消毒、无菌水洗脱后置于马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培养基平板，25 ℃黑暗恒温培养，待产孢后单孢分离获纯化菌株，致病性确认后保存备用。

1.2 方法

1.2.1 致病性测定与形态学特征观测 依据柯赫氏法则（Kochs Postulates）进行致病性测定。将纯化的单孢菌株接种PDA培养基平板，25 ℃黑暗恒温培养，以无菌水洗脱孢子，用血球计数板测定孢子浓度，并用无菌水将孢子浓度调至105个/mL。将闽楠苗茎干经75%酒精表面消毒后，用经高温高压灭菌的昆虫针轻轻刺伤表面，把制备好的分生孢子悬浮液涂布于刺伤部位，用保鲜袋套住接种部位，内放置湿脱脂棉球保湿。另一批不做刺伤，仅进行表面消毒和孢子液涂布保湿。每处理3次重复，设无菌水对照。发病后从病斑分离病原菌。

将病原菌接种到PDA平板，25 ℃黑暗恒温培养，观察菌落培养形状，待培养菌落20 d后，以水作浮载剂，尼康Nikon Ni-U正置荧光显微镜观察菌株菌丝、分生孢子梗、分生孢子等形态，测定其大小[22-23]。

1.2.2 分子生物学鉴定 菌株菌丝采用玻璃纸PDA培养基平板培养收集；DNA提取参照CTAB提取法[23]；采用通用引物ITS1/ITS4、GAPDH1a/ GAPDH1b、Bt1a/Bt1b、H3-1a/H3-1b扩增病原菌株核糖体DNA内部转录间隔序列（Internal Transcribed Spacer，ITS）[22]GAPDH、β-tubulin以及Histone 3的基因序列[24-25]。引物详细信息见表1。50 μL的PCR反应体系为：模板DNA 2.0 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，加ddH2O补足到50 μL。PCR反应参数为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min， 50～58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃后延伸10 min，30个循环后16 ℃保存。扩增后纯化产物委托上海生工生物技术服务有限公司测序，序列提交NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）網站进行序列同源性比对分析，以Botryosphaeria为外群种，应用MEGA 7.0软件将ITS、GAPDH、β-tubulin、Histone3，4个基因片段拼接并用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建菌株系统发育树，Bootstrap法进行检验，重复计算1 000次[22-23， 26-27]。

1.2.3 病原SS-03菌株生物学特性测定

（1）培养基对SS-03菌株菌丝生长和产孢量的影响。供试主要培养基有：水琼脂（water agar，WA）培养基、PDA培养基、马铃薯蔗糖琼脂（potato sugar agar，PSA）培养基、PDA+维生素B6琼脂（PDA+VB6）培养基、300 g/L闽楠叶煎汁琼脂（P. bournei s Leaf agar，PBLA）培养基、PDA+300 g/L闽楠叶煎汁（PDA+ P. bourneis Leaf，PDA+PBL）培养基、查彼（Czapek）培养基、燕麦琼脂（Oatmeal agar，OA）培养基，各供试培养基参照前人[29-31]的方法进行制备。将直径6 mm菌株菌饼接种各供试培养基，25 ℃黑暗条件恒温培养，15 d后观察菌落培养性状，“十字交叉法”测定菌落生长情况，20 d后镜检各培养基菌株产孢量，各培养基均设3次重复。

（2）温度对SS-03菌株菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响。SS-03菌株菌饼（Φ=6 mm）接种PDA培养基后，分别置5、10、15、20、25、28、30、32、35 ℃不同温度梯度，黑暗培养，15 d后以“十字交叉法”观测菌落生长情况，20 d产孢后血球计数板镜检统计不同温度条件对菌株产孢量的影响。孢子萌发测定采用悬滴法，浓度1.0×106 个/mL分生孢子悬浮液置上述温度梯度黑暗恒温培养20 h后，镜检统计分生孢子萌发率。各温度处理均重复3次。

（3）pH对SS-03菌株菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响。采用HCl（1 mol/L）溶液和NaOH（1 mol/L）溶液分别调节PDA培养基pH至3.0～12.0间10个梯度，取菌株菌饼（Φ=6 mm）接种上述pH的PDA培养基，置25 ℃黑暗恒温培养，15 d后测定菌落直径，20 d镜检不同pH下的产孢量。上述pH下，浓度1.0×106 个/mL分生孢子悬浮液均匀涂布具同样pH的琼脂载玻片，25 ℃无菌状态恒温培养20 h后，镜检统计分生孢子萌发率，每个处理均重复3次。

（4）光照对SS-03菌株菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响。菌株菌饼（Φ=6 mm）接种PDA平板，置全黑暗（光照/黑暗=0 h/24 h）、12 h光暗交替（光照/黑暗=12 h/12 h）和日光灯连续照射（光照/黑暗=24 h/0 h）等3种光照处理，25 ℃恒温培养，15 d后观测菌株菌落生长情况，20 d后镜检统计不同光照对菌株产孢的影响。分生孢子萌发采用悬滴法，分别置上述3种光照处理，无菌状态25 ℃恒温培养20 h，待分生孢子萌发后镜检统计孢子萌发率。每处理设重复3次。

（5）C、N源对菌丝生长和产孢的影响。以Czapek培养基为基础培养基，葡萄糖、可溶性淀粉、甘露醇、果糖、麦芽糖和乳糖作为碳源，以等质量KNO3、（NH4）2SO4、NH4NO3、牛肉浸膏、蛋白胨为氮源，以不添加C、N源作对照，25 ℃黑暗恒温培养15 d，分别观测不同C、N源对病原菌菌丝生长的影响，20 d后镜检统计产孢量。每处理重复3次。

（6）相对湿度对SS-03菌株孢子萌发的影响。浓度1×106 个/mL孢子悬浮液均匀涂布载玻片，无菌状态自然晾干，置于相对湿度分别为50%～ 100%等6种不同梯度的密闭干燥器，以及孢子悬浮液等7种湿度处理，25 ℃黑暗恒温培养，20 h后镜检分生孢子萌发情况，每处理设重复3次。

1.3 数据处理与分析

采用IBM SPSS Statistics 22.0和Office Excel 2007对试验数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌株分离纯化及致病性测定

闽楠溃疡病病组织经病原分离、纯化，共获得SS-01、SS-02、SS-03、SS-04等单孢菌株4株，致病性测定结果表明，细针刺有伤接种和无伤接种仅SS-03菌株能够侵染闽楠引起溃疡病，而无伤接种发病滞后。SS-03菌株有伤接种枝条接种部位初为水渍状，逐步向接种部位外围扩展成黑褐色片状溃疡状病斑，表皮坏死，韧皮部发黑，后期严重时包围整个枝条，导致顶部枝叶枯萎不脱落，潮湿环境下发病部位常密布病原菌丝（图1），这与野外自然发病症状表现一致，且能够再次从发病部位分离到相应的接种菌。依据柯赫氏法则，可确定菌株SS-03为闽楠溃疡病致病菌。

2.2 病原鉴定

2.2.1 形态学特征观测 PDA固体培养基上，SS-03菌株菌落生长缓慢，气生菌丝致密絮状，菌落初期白色，后期由菌落中心逐渐变为橘黄色，具有橘黄色颗粒，培养基背面由无色逐渐转为橘黄色。SS-03菌株菌丝无色，具隔膜；具2种分生孢子梗，初级分生孢子梗有1～2轮状分枝，大小为103.4～200.7 μm×2.0～3.5 μm，瓶梗2～4轮，顶部渐尖。次级分生孢子梗2～4轮分枝，大小为54.2～133.5 μm×2.3～6.2 μm；分生孢子卵状椭圆形，无色，无隔膜，大小为4.8～7.0 μm × 2.5～4.6 μm（图2）。根据培养性状和形态特征，参阅文献资料[32-34]，初步将闽楠溃疡病致病菌SS-03菌株确定为粉红粘帚霉（Clonostachys rosea Schroers， et al.=Gliocladium roseum Bainier），其有性态为淡色生赤壳菌（Bionectria ochroleuca）。

序列分析和发育树构建 首先用通用引物 ITS1/ITS4扩增测序后獲SS-03菌株rDNA-ITS序列，长度542 bp。NCBI在线BLAST比对后，SS-03菌株的碱基序列与粘帚霉属（Clonostachys）的碱基序列相似度达100%。其次用通用引物 ITS1/ITS4、GAPDH1a/GAPDH1b、Bt1a/Bt1b、H3-1a/H3-1b，PCR扩增均有目的条带产生，测序拼接后比对，碱基序列与粘帚霉属（Clonostachys）的碱基序列相似度达97%～99%，用MEGA 7.0软件NJ法构建系统发育树（图3，图4）后发现发育树形成了明显的分枝，其中SS-03菌株与编号为KU350736.1的粉红粘帚霉聚为一类，遗传距离近，其中编号HQ654905.1为有性态淡色生赤壳菌。结合形态学特征确定SS-03菌株为粉红粘帚霉。

2.3 病原菌生物学特性观测

2.3.1 培养基对病原菌丝生长和产孢的影响 不同培养基对粉红粘帚霉SS-03菌株菌落生长的影响差异显著（p<0.05）（表2）。各供试培养基中，SS-03菌丝以PDA+PBL培养基菌落生长最快，直径最大，其次是PDA+VB6和PBLA培养基，而菌株菌丝在WA培养基中不生长。

2.3.2 温度对病原菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响 不同温度对粉红粘帚霉SS-03菌株菌落生长、分生孢子形成和孢子萌发的影响差异显著（p<0.05）（图5）。当温度在10～32 ℃时，菌株菌丝均可以生长，以20～28 ℃时生长良好，其中25 ℃是菌丝生长的最佳温度，平均菌落直径达3.92 cm，显著高于其他温度处理（p<0.05），而当温度≤5 ℃或者≥35 ℃时菌丝停止生长；当温度在10～35 ℃之间，均可以产生分生孢子，最适产孢温度为25 ℃，产孢量为5.01×108 个/mL，当温度≤10 ℃或者≥35 ℃时，菌株则不产孢；分生孢子在10～35℃之间，均可以萌发，最适萌发温度为25 ℃，萌发率达96.3%，当温度≤10 ℃时，孢无法萌发。

2.3.3 pH对菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响

不同pH对粉红粘帚霉SS-03菌株菌丝生长、孢子形成和分生孢子萌发的影响差异显著（图6，图7）。SS-03菌丝在pH 3.0～12.0之间均可生长，以pH 6.0～8.0时，菌丝生长较快，其中最适生长pH为6.0，而pH 3.0条件下菌株菌落直径最小。菌株以pH>3.0时开始产孢，以pH 7.0～9.0产孢量较多，最适产孢pH为7.0，产孢量达5.55×108个/mL。pH 3.0～12.0间菌株分生孢子均可萌发，其中pH 5.0～9.0间孢子萌发率>70%，最适萌发pH为8.0，pH 10.0～12.0碱性区间孢子萌发率<50%。

2.3.4 光照对菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响

粉红粘帚霉SS-03菌株菌落直径和产孢量受

光照条件影响差异显著（p<0.05）（图8，图9）。不同光照条件测定结果表明，黑暗条件下菌株菌落生长最快，高达4.06 cm；光暗交替条件次之，直径3.88 cm；连续光照条件菌落生长最慢，直径为3.12 cm。产孢量测定结果表明，全黑暗情况下菌株菌落产孢量最多，分生孢子浓度5.75× 108 个/mL；黑暗交替处理下产孢量次之，浓度为4.55×108 个/mL；连续光照处理则产孢量最少，浓度2.64×108 个/mL。全光照培养后期，菌株菌落为橘黄色，颜色较其他光照处理明显。光照对孢子萌发具有一定影响，光照时间越长，分生孢子的萌发率反而降低。

2.3.5 C/N源对菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响 不同C源对粉红粘帚霉SS-03菌株菌丝生长

和产孢的影响存在一定的差异（p<0.05）（图10，

图11）。基础培养基添加不同C源后均能够显著促进菌株菌落生长和孢子形成，以麦芽糖为碳源

最有利于菌株菌落生长，平均直径6.02 cm，而产孢量最多的是可溶性淀粉培养基，其次是甘露醇、葡萄糖，无碳源产孢量最少。菌株菌丝生长最适C源为麦芽糖，最适产孢C源为可溶性淀粉。不同N源对粉红粘帚霉SS-03菌株菌丝生长和产孢的影响存在一定的差异（p0.05）（图12，图13）。基础培养基添加不同N源后，除（NH4）2SO4外，均能够显著促进菌株菌落生长，以牛肉浸膏为N源最有利于菌株菌落生长，直径7.01 cm，最适菌丝生长N源为牛肉浸膏；添加不同N源后，均能够显著促进菌株分生孢子形成，亦以牛肉浸膏为N源有最利于菌株分生孢子形成，每皿浓度为2.64×108 个/mL。

2.3.6 相对湿度对分生孢子萌发的影响 相对湿度对粉红粘帚霉SS-03菌株分生孢子萌发的影响较大（表3），分生孢子萌发率随相对湿度的提高而增加。相对湿度达60%时，分生孢子开始萌发，萌发率随相对湿度的提高而增加，以90%～100%和孢子悬浮液萌发率最高，但相对湿度60%～80%时分生孢子的萌发率极低，不超过30%。

3 讨论

粘帚霉属真菌（Clonostachys spp.）广泛分布于土壤中[35]，严林、侯思文、Bienapfl等分别报道了粉红粘帚霉可致柴达木地区的枸杞根腐病[11]

及大豆的根腐病[36]、甘肃临夏高寒阴湿地区蚕豆根腐病[15]，感病植株根系被病原菌破坏后，水分输导会大大受阻，光合作用也会受到影响，降低产量[37]。唐建阳等[10]和罗萍[12]的研究表明其还可致龙眼和梨储藏期间的烂果。我们对闽楠溃疡病研究确定其致病菌SS-03为粘帚霉属（Clonostachys）粉红粘帚霉（Clonostachys rosea），这与周翠等[38]在苹果枝干发病部位分离的粉红粘帚霉菌株类似。在有伤接种和无伤接种下菌株均可侵染，但有伤时病菌更易侵入，自然情况下林分多虫害时，溃疡病更易爆发。同时，通过生物学特性测定结果可知，SS-03菌株在不同培养基中菌落生长速率和生长状态有较大差异，在PDA+闽楠煎汁培养基中生长最好，而在WA培养基无法生长，说明菌株需要碳源和氮源来供其生长。在闽楠煎汁培养基中，同样没有加入碳源和碳源，但是菌株的菌丝在培养基上长势较旺，说明闽楠叶片为这种菌株的生长提供了生长所需元素，这也为这种真菌在侵染过程中提供了生存基础。菌丝在10～32 ℃均可以正常生长，其中温度在20～28 ℃时生长良好，25 ℃时菌丝的生长速度最快。且随着湿度的增加，孢子萌发率越来越高。孢子悬浮液的萌发率可高达96.7%。符合闽楠溃疡病在高温高湿条件下易于流行发生的规律。10～35 ℃之间时菌株均可以产生分生孢子，最适产孢温度为25 ℃，当温度≤10 ℃或者≥35 ℃时，菌株不产孢。10～35 ℃之间孢子在均可以萌发，25 ℃为最适萌发温度，当温度≤10 ℃或者≥35 ℃时，孢子无法萌发，这与现场调查该病害在春夏季为危害高峰期的结果相一致；光照下粉红粘帚霉菌丝生长缓慢，黑暗条件下菌丝生长最快，光暗交替下生长速率居中，同时光照会促进菌株提前产孢，但会抑制产孢量，且随着光照时间的增长，孢子萌发率逐渐降低。可见林分郁闭度高，透光度较差时易于病害传播，因此对发病的植株适当的增加光照强度和光照时间可以抑制菌丝的生长和产孢量。以麦芽糖为碳源的培养基有利于菌株菌落的生长，可溶性淀粉有利于产孢。菌株在牛肉浸膏为氮源的培养基中菌落生长和产孢量均最大。对照在没有氮源或者碳源时生长速率虽然快，但是菌丝在培养基上生长的十分稀薄，只有表面浅浅的一层菌丝，可能是由于菌丝吸收了局部的营养后快速扩展吸收其他区域的营养以维持生长所致，这也表明碳源和氮源都是菌丝生存所必需的物质，缺少其中一种元素菌株的长势势必会有所下降。

故在闽楠苗木培养时期，应注意播种密度，保证苗木通风度和见光度，科学合理的控制灌溉湿度，避免湿度过大，或者积水过多。营造闽楠林分时，合理密植，通风透光，控制林内温湿度。还应提前做好病害防御，避免昆虫抓伤或啃食树皮造成损伤，从而增加病害发生概率，必要时可以采取提取喷施化学药剂的措施，防止病害大规模爆发。此外，若发生病害，应科学处理病枝，防止病枝侵染健康树木。因粉红粘帚霉菌具有生防效果，后期研究可考虑将因其发病的病枝进行加工处理，作为生防药剂，环保处理病枝的同時，变废为宝，一则发酵可为植物提供营养，二则可以对由黄单胞杆菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo）引起的水稻白叶枯病以及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有较好的拮抗作用[16-18]。

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