外源调节物质对柑橘果实高温胁迫的抗氧化效应

万继锋　李娟　杨为海　曾辉　张汉周　陈杰忠

摘 要 以抗坏血酸（AsA）、氯化钙（CaCl2）和水杨酸（SA）3种外源调节物质叶面喷施盆栽暗柳橙果实后，置于环境调控生长室中进行38 ℃高温处理，探讨3种不同性质外源调节物质对柑橘果实高温胁迫的抗氧化效应。结果表明：在高温胁迫下，施用外源AsA、CaCl2和SA均可显著降低果皮组织的超氧阴离子自由基（O2?）和丙二醇（MDA）含量，提高果皮组织的超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性及AsA和谷胱甘肽（GSH）含量。这说明3种外源调节物质均能减轻膜脂过氧化程度，提高保护酶活性，对柑橘果实高温胁迫具有缓解效应。

关键词 柑橘；抗坏血酸；氯化钙；水杨酸；高温胁迫；抗氧化

中图分类号 S666 文献标识码 A

Abstract After being sprayed with exogenous ascorbic acid （AsA）， calcium chloride （CaCl2） and salicylic acid （SA）， potted sweet orange seedlings of ‘An liu （Citrus sinensis Osbeck） were cultured at 38 ℃ in an environmental regulation-growth room. The mitigative effects of the three exogenous regulators on high temperature stress of citrus fruits were studied. The results showed that under the stress of high temperature， the three exogenous regulators could reduce the contents of O2? and the MDA， increase the activities of SOD and POD， and the contents of AsA and GSH. It is concluded that the three exogenous regulators treatment could enhance the thermotolerance of citrus fruits.

Keywords citrus； ascorbic acid； calcium chloride； salicylic acid； high temperature stress； antioxidant

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.012

柑橘果实日灼是一种常见的主要由高温与强光胁迫引起的生理病害，每年都会给生产上造成一定损失[1-3]。果实日灼的发生与果实表面温度直接相关，当果实表面达一定“阈值”温度，日灼才有可能发生[4]。因此，果实日灼的发生必然与果实耐热性密切相关。然而，耐热性强弱主要取决于果实对高温胁迫的抗氧化特性。研究表明，高温胁迫下外源调节物质可通过调节植物抗氧化系统，提高抗氧化酶的活性和抗氧化剂的含量来增强其耐热性。抗坏血酸（AsA）处理可提高苹果、猕猴桃、百合等植株及苹果果实的耐热性[5-8]。Ca2+处理可增强玉米、柑橘、蝴蝶兰、滨梅、叶用莴苣等植株的耐热性[9-13]。水杨酸（SA）处理可提高百合、蝴蝶兰、铁皮石斛、葡萄、东北对开蕨、一串红、蓝莓等植株及苹果果实的耐热性[8， 11， 14-19]，而将外源调节物质应用于柑橘果实耐热性研究尚未见报道。本研究以外源AsA、CaCl2和SA叶面喷施盆栽柑橘果实后，置于环境调控生长室中进行38 ℃高温处理，研究不同性质外源调节物质对柑橘果实高温胁迫的缓解效应，探讨不同性质外源调节物质处理对柑橘果实耐热性的影响，为其耐热性提高及生产应用上采取缓解高温伤害的调控措施提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以三年生生长较为一致、挂果适量均匀的盆栽红橘（Citrus tangerine Hort ex Tanaka）砧木暗柳橙（Citrus sinensis Osbeck）为实验材料。

1.2 方法

1.2.1 实验处理 实验在华南农业大学园艺学院环境调控生长室进行。在高温处理前一天下午，选择生长较为一致、挂果适量均匀的盆栽柑橘树，参考张建光等[8， 20]分别用0.5%氯化钙（CaCl2）、10 mmol/L抗坏血酸（AsA）和0.2 mmol/L水杨酸（SA）溶液叶面喷施盆栽暗柳橙果实，以不喷施处理为对照（CK）。然后，从2 d起进行38 ℃高温处理，处理时间为4 h，温度调控为38 ℃/ 28 ℃（7：00—11：00，33 ℃；11：00—15：00，38 ℃；15：00—19：00，33 ℃；19：00—23：00，30 ℃；23：00—3：00，28 ℃；3：00—7：00，30 ℃），于高温胁迫的0、1、3、5、7 d削取相应果皮，用液氮固定后带回实验室，置于–80 ℃低温冰箱备用。为了避免水分胁迫，在高温处理期间每天傍晚给予树体充足的水分供应，缓慢灌水直至水从盆底溢出为止。每种处理重复5次，每次重复1株树。

1.2.2 测定方法 超氧阴离子自由基（O2?）含量的测定采用羟胺法，抗坏血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）含量的测定参照万继锋等[1]的方法，丙二醛（MDA）含量的测定采用硫代巴比妥酸法，超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用氮蓝四唑法，过氧化物酶（POD）活性的测定采用愈创木酚法[21]。所有指标测定均以鲜重计。

1.3 数据分析

所有数据经Microsoft Office Excel统计分析，采用Duncan新复极差作显著性测验。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫下外源调节物质对果皮细胞膜脂过氧化的影响

如图1-A所示，高温胁迫下果皮O2?产生速率均呈先下降后上升的变化趋势。高温胁迫1 d，各处理的O2?产生速率下降到最低，随高温胁迫时间延长（3～7 d），各处理的O2?产生速率逐步上升。在高温胁迫期间，对照处理的O2?产生速率始终高于AsA处理，AsA处理的O2?产生速率始终高于SA处理，SA处理的O2?产生速率始终高于CaCl2处理。各处理的O2?产生速率在高温胁迫0 d时差异不显著，但在高温胁迫1～7 d，AsA、CaCl2和SA处理的O2?产生速率显著低于对照处理，尤其是在胁迫3 d时AsA、CaCl2和SA处理的O2?产生速率比对照处理的低25.94%、59.34%和52.94%。说明AsA、CaCl2和SA处理能够抑制O2?产生速率，减轻活性氧的伤害。从效应上看，以CaCl2和SA处理的效果较好。

如图1-B所示，高温胁迫下果皮MDA含量均呈先下降后上升的变化趋势。高温胁迫初期，各处理的MDA含量下降到最低，随高温胁迫时间延长（3～7 d），各处理的MDA含量逐步上升。在高温胁迫期间，对照处理的MDA含量始终高于AsA处理，AsA处理的MDA含量始终高于SA处理，SA处理的MDA含量始终高于CaCl2处理。各处理的MDA含量在高温胁迫0 d时差异不显著，但在高温胁迫1～7 d，AsA、CaCl2和SA处理的MDA含量显著低于对照处理，尤其是在胁迫3 d时AsA、CaCl2和SA处理的MDA含量比对照处理的低14.38%、27.34%和21.09%。说明AsA、CaCl2和SA处理能减轻膜质过氧化，减缓了高温对果皮细胞膜的损伤。从效应上看，以CaCl2和SA处理的效果较好。

2.2 高温脅迫下外源调节物质对果皮抗氧化酶的影响

随着高温胁迫时间的延长，各处理的SOD活性呈先升后降的变化趋势。各处理的SOD活性均在高温胁迫1 d时达到峰值。在高温胁迫期间，CaCl2处理的SOD活性始终高于SA处理，SA处理的SOD活性始终高于AsA处理，AsA处理的SOD活性始终高于对照处理（图2-A）。各处理的SOD活性在胁迫0 d差异不显著，但在胁迫1～7 d，

AsA、CaCl2和SA处理的SOD活性显著高于对照处理，尤其是在胁迫3 d时AsA、CaCl2和SA处理的SOD活性比对照处理的高出15.07%、21.91%和19.18%。表明AsA、CaCl2和SA处理能够提高SOD活性，从而增强清除O2?的能力。从效应上看，以CaCl2和SA处理的效果较好。

高温胁迫下，各处理的POD活性变化趋势相似，均在高温胁迫1 d达峰值后下降。在高温胁迫期间，SA处理的POD活性始终高于CaCl2处理，CaCl2处理的POD活性始终高于AsA 处理，AsA处理的POD活性始终高于对照处理（图2-B）。各处理的POD活性在高温胁迫0 d差异不显著，但在高温胁迫1 d后，各处理的POD活性差异显著。在胁迫3～7 d时，AsA处理的POD活性比对照处理的分别高出28.95%、19.84%、12.50%；CaCl2处理的POD活性比对照处理的分别高出32.05%、42.63%、21.98%；SA处理的POD活性比对照处理的高出46.63%、57.49%、42.08%。表明AsA、CaCl2和SA处理能够提高POD活性，从而增强清除H2O2的能力。从效应上看，以SA和CaCl2处理的效果较好。

2.3 高温胁迫下外源调节物质对果皮抗氧化剂的影响

由图3-A可知，在高温胁迫1 d，对照、AsA和 SA处理的AsA含量均下降到最低；随着胁迫时间的延长（3～7 d），AsA含量逐渐增加。而CaCl2处理的AsA含量在高温胁迫1 d时达峰值后下降到最低，在胁迫7 d时有所增加。在整个高温胁迫期间，AsA处理的AsA含量始终高于CaCl2处理，CaCl2处理的AsA含量始终高于SA处理，SA处理的AsA含量始终高于对照处理。AsA处理的AsA含量在高温胁迫0 d时显著高于对照处

理，在高温胁迫1 d时AsA含量比对照处理的高出41.96%。SA、CaCl2和对照处理的AsA含量在高温胁迫0 d时差异不显著，但在高温胁迫1 d后差异显著；SA处理的AsA含量在高温胁迫3 d时比对照处理的高出19.42 %；而CaCl2处理在高温胁迫1 d时比对照处理的高出39.50 %。说明了外源AsA、CaCl2和SA处理能抑制高温对AsA的破坏。从效应上看，以AsA和CaCl2处理的效果较好。

从图3-B可看出，胁迫3 d时对照和AsA 处理的GSH含量降到最低；随着胁迫时间的延长 （5～7 d）GSH含量逐渐增加。而CaCl2和SA处理的GSH含量均在高温胁迫1 d达峰值后下降到最低，在胁迫7 d时有所增加。在胁迫期间， AsA 处理的GSH含量始终高于CaCl2处理，CaCl2处理的GSH含量始终高于SA处理，SA处理的GSH含量始终高于对照处理。在高温胁迫0 d，AsA处理的GSH含量显著高于对照处理，SA、CaCl2和对照处理的GSH含量差异不显著；AsA、SA、CaCl2和对照处理的GSH含量在高温胁迫1 d后差异显著，在高温胁迫3 d时AsA、SA、CaCl2处理的GSH含量比对照处理的分别高出31.28%、27.69%、28.72%。说明了外源AsA、CaCl2和SA处理能抑制热胁迫对GSH的破坏。从效应上看，以AsA和CaCl2处理的效果较好。

3 讨论

植物对温度的适应主要在细胞膜，细胞膜是热损伤和抗热系统的中心，其热稳定性是反映了植物的抗热性[15， 17]。MDA是膜脂过氧化的主要产物，其含量直接反映了细胞膜结构的损伤程度[22]。本研究结果显示，在高温胁迫条件下，果实果皮中O2?产生速率和MDA含量显著上升，说明高温胁迫下由活性氧积累引发的膜脂过氧化作用加剧，使MDA含量增加，而MDA的积累必然导致细胞膜的损伤，细胞的生理机能受到破坏。经外源AsA、CaCl2和SA处理后，显著降低了果实在高温胁迫下的O2?产生速率和MDA累积量，说明外源AsA、CaCl2和SA处理可有效减少膜脂过氧化，减轻细胞膜的损伤，提高果实的耐热性。

在正常生理条件下，植物细胞内活性氧的产生和清除处于动态平衡状态，而高温胁迫破坏活性氧的动态平衡，从而产生过多的活性氧，而活性氧被认为是启动植物体内抗氧化系统的重要物质，SOD、POD等酶促防御系统具有清除活性氧的能力，是植物抗热的生理基础之一[5]。本研究结果表明，SOD和POD活性在高温胁迫期间呈现“先升后降”的变化趋势，这说明高温胁迫初期，果实可通过自身的调节机制，提高SOD和POD活性，以适应高温胁迫。随着高温胁迫时间的延长，SOD和POD活性均有较大幅度的下降，而O2?产生速率和MDA含量上升，这意味着果实自身的调节能力已经减弱，内源抗氧化酶系统清除活性氧、防止膜脂过氧化作用的能力下降，致使膜脂过氧化作用加剧，体内活性氧代谢失调。经外源AsA、CaCl2和SA处理后，果皮中SOD和POD活性显著高于对照，这说明外源AsA、CaCl2和SA处理能够提高SOD和POD活性，并使之维持在较高水平，降低高温胁迫对细胞膜的破坏作用，这与一些研究者在其他作物上的结果基本吻合[7， 11， 15]。

抗坏血酸（AsA）和还原型谷胱甘肽（GSH）是植物体内重要的抗氧化物质，通过GSH-AsA循环清除活性氧。本研究结果表明，高温胁迫初期，AsA和GSH含量均有所下降。一方面是高温抑制了AsA和GSH的合成速度，另一方面是高温胁迫下体内活性氧代谢失衡，产生大量的自由基，AsA和GSH作为抗氧化剂参与了自由基的猝灭，因此，其含量降低。随着胁迫时间的延长，AsA和GSH含量均有所上升，这是果皮对高温的适应性反应。随着胁迫时间的延长，果皮对高温已逐渐适应，因此，其含量又逐渐升高。经外源AsA、CaCl2和SA处理后，果皮中AsA和GSH含量显著高于对照，说明外源AsA、CaCl2和SA处理具有维持果实较高水平的抗氧化性物质的能力（AsA和GSH），这对减轻活性氧伤害，提高果实的耐热性有积极作用。

AsA是超氧阴离子和过氧化氢的有效清除剂，同时也是线性氧的碎灭剂[23]；CaCl2中Ca2+作为偶联胞外信号与胞内生理生化反应的第二信使，在植物许多生理过程中起着重要作用[24]；SA是植物体内诱导逆境防御机制的重要信号分子[25]。本研究中，使用的各种外源调节物质对提高果实耐热性都有效果，其中外源AsA对AsA和GSH含量提高的作用最明显，外源CaCl2对SOD活性提高的作用更明显，外源SA对POD活性提高的作用更大，处理效果的差异可能与其不同的调节机理有关。

综上所述，在高温胁迫过程中，外源AsA、CaCl2和SA处理均可降低果皮组织的O2?产生速率和MDA含量，维持果皮组织较高的SOD和POD活性以及AsA和GSH含量，增强果实的耐热性，从而减缓了高温对细胞膜的损伤，缓解了高温对果实造成的伤害。

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