刺葡萄DFR基因植物表达载体构建及转化茉莉花愈伤组织的研究

甘煌灿 赖呈纯 潘红 朱育菁

摘 要 本研究以從刺葡萄克隆获得的DFR基因为目的基因，同时从质粒pCAMBIA1302中扩增获得CaMV35S启动子和NOS终止子，并利用双酶切法构建由CaMV35S启动子驱动DFR基因且带有NOS终止子的表达载体，验证测序结果显示成功构建了pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS植物表达载体，并将该载体转化到农杆菌EHA105中。采用农杆菌注射渗透法转化烟草叶片进行瞬时表达，经鉴定，转化后的烟草叶片中能检测到GFP基因的表达。采用农杆菌介导法将该植物表达载体转化受体茉莉花愈伤组织，经多轮抗性筛选获得了转基因抗性愈伤组织，经PCR鉴定，茉莉花转基因抗性愈伤组织中检测到GFP、Hyg和DFR基因等的存在，初步证明目的基因DFR已成功整合到宿主的基因组中。茉莉花愈伤组织遗传转化体系的建立，验证了花色苷合成相关基因转化茉莉花愈伤组织的可行性，为今后通过植物转基因技术丰富茉莉花的花色奠定基础。

关键词 茉莉花；DFR基因；植物表达载体；愈伤组织；遗传转化

中图分类号 S685.16；Q812 文献标识码 A

Plant Expression Vector Construction and Jasmine （Jasminum sambac （Linn.） Aiton） Callus Transformation of DFR Gene from Spine Grape （Vitis davidii Fo?x.）

GAN Huangcan1，2， LAI Chengchun1*， PAN Hong1， ZHU Yujing2

1 Institute of Agricultural Engineering and Technology， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

2 Agricultural Bioresource Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

Abstract In this experiment， DFR gene encoding dihydroflavonol 4-reductase obtained from spine grape （Vitis davidii Fo?x.） was taken as the target gene， meanwhile， the promoter CaMV35S and terminator NOS was amplified from plasmid pCAMBIA1302. Then， the plant expression vector， which inserted into DFR gene driven by promoter CaMV35S and combined with terminator NOS， was constructed by using double enzyme digestion technique. The detecting and sequencing results revealed that the plant expression vector pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS was constructed successfully. After that the vector was introduced to Agrobacterium tumefaciens EHA105. The transient expression of GFP gene in tobacco leaves was checked with A. tumefaciens EHA105 mediated transformation， and it turned out the GFP gene could be expressed. The plant expression vector pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS was introduced to jasmine calli using agrobacterium-mediated transformation. And then， the resistance jasmine calli was obtained after repeatedly resistance screening. GFP， Hyg and DFR were identified to exist in the genome of resistance jasmine calli by PCR. The preliminary evidence showed that the exogenous DFR gene was integrated into the host cell genome in jasmine calli. The feasibility of the genes related to anthocyanins synthesis introduced into jasmine genome was verified through the establishment of genetic transformation system in jasmine. This study would help build a foundation to enrich jasmine flower colors using plant transgenic technology.

Key words jasmine （Jasminum sambac （Linn.） Aiton）； DFR gene； plant expression vector； callus； genetic transformation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.014

茉莉花（Jasminum sambac （Linn.） Aiton）属木樨科素馨属（Jasminum） （或茉莉属）植物[1-2]，其花香味浓厚，在花茶制作、庭园及盆栽观赏等方面有广泛的用途。然而，茉莉花绝大多数为白色，在人们对丰富花色的追求中处于劣势，在市场上有诸多的局限，难以进一步推广。在改变花色的研究中，由于传统育种方法存在杂交筛选随机性和不稳定性等问题，人们开始积极寻求新的技术来获得植物丰富的花色，并深入研究植物花色苷生物合成代谢的途径[3-5]，这使得植物花色的研究进入了基因时代。但由于基因库的有限度和基因复杂的调控，拥有全部花色谱的植物物种极其少见，多数是累积一些特异的类黄酮而展示了相对有限的花色[6-7]，如在自然条件下，由于不能合成飞燕草色素，四大鲜切花菊花、康乃馨、月季和百合均缺乏蓝色花系[8]。已有研究表明，由于植物花色苷合成相关的结构基因和调控因子的异同，使得利用基因工程技术改变花色成为了可能[9]。前人已利用基因工程技术对花色改造进行了大量研究[10-14]，因此，基因工程技术已成为创造植物新花色的重要育种途径。

目前，许多植物花色苷合成途径中的关键酶和调控因子都已经被克隆[15-16]，其中，二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）是花青素生物合成途径中的关键酶之一[17]，早在1995年，Holton等[3]就从玉米和金鱼草中克隆得到DFR基因序列，并证实其调控会影响花青素的显色作用，人们已从非洲菊[18]、葡萄[19]、小麦[20]、甜橙[21]、蔓越橘[22]、龙船花[23]、矮牵牛[24]、百合[25]、草莓[26]、杨树[27]等许多植物中分离出DFR基因。DFR属NADPH依赖的短链还原酶家族，具有二氢黄酮醇底物选择特异性，相应的氨基酸区域决定了不同物种对底物的优先性[28-29]，合成天竺葵色素、矢车菊色素、飞燕草色素所对应的底物分别为二氢山奈酚（DHK）、二氢槲皮素（DHQ）和二氢杨梅酮（DHM），从而使花色分别显现为橙色到红色、红色到洋红色、紫色到蓝色的花。刺葡萄（Vitis davidii Fo?x.）为葡萄科葡萄属的多年生木质藤本植物，有紫红色、红色及青色等颜色，因此其DFR基因的克隆可为其他植物的花色改造提供基因资源。本研究在成功克隆刺葡萄DFR基因[30]及对植物花色转基因相关研究分析的基础上，构建DFR基因植物表达载体，并探讨花色苷合成相关基因转化茉莉花愈伤组织的可行性，为今后通过植物转基因技术改造茉莉花的花色提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

以从刺葡萄（Vitis davidii Fo觕x.）紫红色愈伤组织[31]克隆获得的DFR基因[30]（GenBank登录号：KF915803）来构建植物表达载体；以烟草（Nicotiana tabacum）组培苗作为瞬时表达植物；以茉莉花愈伤组织[32]为遗传转化的受体材料。大肠杆菌（E. coli）DH5α购自厦门泰京生物有限公司；pACK4a-Bs载体购自盘古基因科技有限公司。采用的根癌农杆菌菌株（Agrobacterium tumefaciens）为EHA105株系，所用质粒为pCAMBIA1302，均由福建农林大学园艺植物生物工程研究所惠赠。

1.2 方法

1.2.1 DFR基因、CaMV35S启动子和NOS终止子的克隆 DFR基因克隆参见赖呈纯等[30]的方法，以pCAMBIA1302质粒的序列设计引物35S-F/35S-R和NOS-F/NOS-R，并以其为模板进行扩增，CaMV35S启动子和NOS终止子的退火温度分别为56、52 ℃。扩增反应结束后，取5 μL反应产物用于琼脂糖凝胶电泳检测。克隆及检测的引物序列见表1。DFR基因、CaMV35S启动子和NOS终止子的PCR产物回收后，与克隆载体pACK4a-Bs连接，然后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取白斑摇菌后，送铂尚生物技术有限公司测序验证。

1.2.2 植物表达载体构建与转化 将质粒pACK4a-35S与pCAMBIA1302载体进行EcoR I/Kpn I双酶切后，再进行连接，获得pCAMBIA1302-35S质粒；然后再将pACK4a-DFR与pCAMBIA1302-35S质粒进行Kpn I/Xba I双酶切，连接后获得pCAMBIA1302-35S-DFR质粒；最后将pACK4a-NOS与pCAMBIA1302-35S-DFR质粒进行Xba I/Hind III双酶切，获得pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS载体。以上步骤中，连接均用T4 DNA ligase连接酶16 ℃过夜并转化于大肠杆菌DH5α中进行扩增。构建成功后进行双酶切及PCR检测。将重组质粒pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS通过冻融法导入农杆菌EHA105。

1.2.3 煙草的瞬时表达 以烟草组培苗为待试烟草植株。利用农杆菌注射渗透法转化烟草叶片，参照孙蔓莉等[33]的方法进行。

1.2.4 茉莉花愈伤组织转化 茉莉花愈伤组织抗生素敏感性试验参照匡云波等[34]的方法并适当改进，将生长良好的茉莉花型愈伤组织分别培养于添加有不同浓度的抑菌性抗生素头孢霉素（0、100、200、300、400 mg/L）和选择性抗生素潮霉素（0、5、10、15、20 mg/L）的培养基中，于23～25 ℃光照下培养14 d，观察头孢霉素和潮霉素对茉莉花愈伤组织生长的影响。

茉莉花愈伤组织与农杆菌共培养：挑取转化的农杆菌EHA105单菌落，接种于3 mL含50 mg/L利福平和50 mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，于28 ℃、250 r/min振荡培养24 h，再按1%接种量将菌液转移到新鲜的含有相应抗生素的YEB液体培养基中，继续培养至OD=0.5（3～4 h，可适当延长）。将培养好的菌液在5 000 r/min条件下离心5 min，收集菌体并将菌体重悬于1/2体积的重悬液M2，于28 ℃、120 r/min继续振荡培养4～6 h用于侵染。将茉莉花愈伤组织的四周切出伤口，接种于预处理培养基M3中高渗处理4～5 h。然后取出愈伤组织于无菌滤纸上风干20 min待侵染。将预处理过的愈伤组织转入上述菌液中，于25 ℃、80 r/min条件下振荡30 min，取出愈伤组织后用无菌滤纸吸干多余的菌液，然后转入共培养基M4中，于室温（24±1）℃、光照条件下培养2～3 d。

抗性愈伤组织的筛选：共培养后，先用无菌水将横切薄片清洗3～5次，然后用含300 mg/L头孢霉素的无菌水清洗2次，静置30 min。转入第一轮筛选培养基M5中，于28 ℃下，暗培养7 d左右直至愈伤组织恢复生长。然后于光照下培养10～15 d，光照时间为16 h/d。将第1轮筛选后所得抗性愈伤组织转接到第2轮筛选培养基M6中，进一步筛选抗性愈伤组织，每14 d更换一次培养基，共进行3～4批筛选。

绿色荧光和PCR检测：利用荧光体式显微镜观察筛选获得的茉莉花抗性愈伤组织中报告基因GFP的表达情况。同时，取适量的抗性愈伤组织提取DNA，并以未转化的茉莉花愈伤组织DNA作为对照，DNA提取后稀释成一致浓度。用来检测目的基因DFR、抗性基因Hyg及报告基因GFP是否成功导入茉莉花愈伤组织。

1.2.5 培养基 本试验所用培养基配方及成分如表2所示。

2 结果与分析

2.1 刺葡萄愈伤组织DFR基因、CaMV35S启动子和NOS终止子的分离

经PCR扩增TA克隆后，获得DFR基因的ORF区，目的片段大小为1.2 kb左右（图1-A）。同时，经PCR扩增TA克隆后，获得CaMV35S启动子和NOS终止子片段，分别为600、300 bp左右（图1-B、C）。并回收TA克隆产物，获得克隆载体质粒pACK4a-DFR、pACK4a-35S和pACK4a-NOS。

A： DFR gene； B： CaMV35S； C： NOS； M： 100 bp Plus II DNA ladder Marker.

图1 DFR基因、CaMV35S启动子和NOS终止子PCR

扩增产物

Fig. 1 PCR products of DFR， CaMV35S and NOS

2.2 植物表达载体构建

将pACK-35S质粒与pCAMBIA1302载体进行EcoR I/Kpn I双酶切后，用T4 DNA ligase进行连接，获得pCAMBIA1302-35S质粒；然后再将pACK4a-DFR质粒与pCAMBIA1302-35S质粒进行Kpn I/Xba I双酶切，连接后获得pCAMBIA1302-35S-DFR质粒；再将pACK4a-NOS与pCAMBIA1302-35S-DFR质粒进行Xba I/Hind III双酶切，连接获得pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS载体（图2）。最后转化大肠杆菌DH5α，质粒扩增后，提取质粒进行PCR和双酶切验证（图3-A、B），并测序验证。验证结果表明，含刺葡萄DFR基因的植物表达载体已成功构建。

2.3 植物表达载体转化农杆菌EHA105

将携带刺葡萄DFR基因的植物表达载体转化农杆菌EHA105感受态细胞，经扩增培养后进行PCR检测，结果见图4，NptII抗性基因、GFP荧光标记基因的片段长度均为在700～800 bp左右，而DFR基因和35S-DFR片段的长度分别为1.2、1.8 kb左右。这与预计的目的片段长度一致，因此，判断此4条特异性DNA条带即为目标DNA条带，这表明目的质粒已经转化农杆菌EHA105。

2.4 烟草瞬时表达及GFP检测

利用农杆菌注射渗透法转化烟草叶片检测质粒载体pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS瞬时表达。在488 nm波长的蓝色激发光下，观察注射后的烟草叶片的表皮（取多个重复），结果发现烟草的表皮发出明亮的绿色荧光，并且绿色荧光在叶脉四周有清晰地分布，而其他部位也检测到绿色荧光并呈现均匀分布，如图5所示。持续的观察表明，在农杆菌侵染后1 d未见GFP表达，直到侵染后2 d才开始表达，并且在3 d达到最大值，4～6 d保持不变，一周后荧光出现下降趋势。这表明构建的质粒载体pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS可在烟草叶片中瞬时表达。

2.5 茉莉花愈伤组织的抗生素敏感性试验

2.5.1 头孢霉素敏感性试验 在其他培养条件一致的情况下，将茉莉花愈伤组织接种于含有不同浓度头孢霉素的培养基上培养，观察愈伤组织的生长情况（图6-A～D）。观察结果表明，头孢霉素浓度在100～400 mg/L范围内，茉莉花愈伤组织生长率均为100%。这说明不同浓度的頭孢霉素对茉莉愈伤组织生长的影响不明显，不会抑制其生长。此外，观察结果还可看出，在添加头孢霉素后，愈伤组织的颜色明显变深，且随着头孢霉素浓度的升高，茉莉花愈伤组织的生长速度呈下降趋势。综合考虑愈伤组织的生长和遗传转化，以头孢霉素浓度400 mg/L作为筛选时抑制农杆菌EHA105生长的浓度。

2.5.2 潮霉素敏感性试验 将茉莉花愈伤组织接种于含有不同浓度潮霉素的培养基上培养，其生长情况的观察记录见表3和图6-E～H。由表3可知，茉莉花愈伤组织对潮霉素很敏感，在潮霉素浓度为5 mg/L

时很明显地抑制愈伤组织的生长，愈伤组织生长率为50%；而在10 mg/L时，其愈伤组织生长率为3.33%；在更高浓度（15、20 mg/L）时，其褐变率达到了100%。因此，可先以5 mg/L潮霉素进行茉莉愈伤组织的预筛选，然后再逐渐增加潮霉素的浓度逐步筛选。

2.6 茉莉花愈伤组织转化

2.6.1 茉莉愈伤组织的转化与抗性筛选 茉莉花愈伤继代培养时，一般需要5～7 d来适应新的培养环境后才恢复生长。农杆菌侵染茉莉花愈伤组织后，一开始就采用较高浓度抗生素（潮霉素）的筛选培养基，容易导致转化材料褐变死亡，较难得到良好的愈伤组织。而采用逐步提高潮霉素选择压，有利于茉莉花抗性愈伤组织的获取。从观察的统计数据分析可看出，经与农杆菌EHA105共培养后的茉莉花愈伤组织，转接到M5培养基中进行第1轮培养，第1轮培养筛选后愈伤组织的成活率在46.67%～56.67%之间，说明在较低潮霉素浓度的筛选培养基中培养7 d左右有利于转化后茉莉花愈伤组织生长的恢复。挑取第1轮筛选后恢复生长且生长状态较好的茉莉花愈伤组织，转到M6培养基中进行第2轮筛选，培养14 d后进行统计，抗性愈伤组织的成活率较高，平均可达66.67%左右，随后再将获得的茉莉花愈伤组织反复转接到M6培养基中筛选3～4次，有部分茉莉花愈伤组织逐渐出现褐化死亡，说明假阳性在连续的筛选培养中逐渐被剔除，最终获得生长较一致的茉莉花抗性愈伤组织。

2.6.2 抗性愈伤组织GFP基因表达的检测 在荧光体式显微镜下，图7是检测筛选多代后获得的茉莉花抗性愈伤组织。从图7可看出，茉莉花的抗性愈伤组织是由转化和非转化细胞团混合共生的，未转化细胞团未发出荧光，而转化细胞团则发出较强的绿色荧光（图7-A、B）。同时对愈伤组织进行切片处理，获得单细胞切片，未转化的细胞未见有自发绿色荧光，而转化细胞可清楚观察到自发绿色荧光的存在（图7-C）。虽然发光强度有所不同，但约90%的抗性细胞都发出可检测的绿色荧光，并且细胞壁和细胞膜的亮度较强。这充分说明经过抗性筛选后已获得了茉莉花转基因愈伤组织。

2.6.3 抗性愈伤组织的PCR检测 选取生长良好的、适量的茉莉花转基因愈伤组织提取DNA，并进行目的基因DFR、35S-DFR、荧光基因GFP、抗性基因Hgy的PCR检测，以未转化的茉莉花愈伤组织作为对照，PCR扩增结果见图8。从图8可看出，目的基因DFR和抗性基因Hyg在未转化的愈伤组织中有微弱的表达，而经遗传转化的茉莉花抗性愈伤组织，其表达有显著的增强，重复3次的PCR扩增结果均证明了这一点。从报告基因GFP和重组片段35S-DFR扩增的结果看，在未转化的茉莉花愈伤组织未扩增出预期片段，但其在茉莉花抗性愈伤组织中却有显著的表达，一是重组目的片段35S-DFR的PCR电泳图中出现了大小为1.8 kb左右的目的条带，二是报告基因GFP的PCR电泳图中出现了大小为700 bp左右的目的条带，这与预计的2个片段条带大小相符。综上所述，初步证明包含目的基因DFR的质粒已成功整合到茉莉花愈伤组织基因组中，但有待进一步的分子生物学分析。

3 讨论

3.1 茉莉花转化DFR基因的价值

茉莉花用途广泛。然而，茉莉花花色单一，绝大多数为白色，极大影响了其观赏价值。已有研究表明，茉莉在自然条件下结实率很低，双瓣茉莉自然结实率仅為0.19%[35]，并且种子在自然条件下难以萌发，实践中很多种植了10多年的农户未见过茉莉花种子和由种子自然萌发而长成的茉莉花实生苗。这使得利用传统的育种方法来改良茉莉花性状或进行花色改造存在巨大的困难。随着现代生物技术的发展，基因工程技术为花卉的改良提供了全新的思路，转基因技术已广泛应用于植物花色改造[11-14]。二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）是花青素合成途径过程中的关键酶之一[29， 36]，并且该基因在植物花色基因工程中已有应用[37-38]，本研究以该基因为重组的外源基因进行研究，具有较强的理论意义和实用价值。

3.2 潮霉素相关问题探讨

在茉莉花抗性愈伤组织的PCR验证中，在未转化的茉莉花愈伤组织中检测到Hyg基因的极微弱表达，通过查询相关的文献，其原因可能是PCR反应体系存在污染，而且这种污染是比较难去除的。但从茉莉花愈伤组织对潮霉素敏感性试验中，茉莉花愈伤组织对潮霉素反应敏感，这与许多前人的研究结果类似[39-40]。浓度为5 mg/L的潮霉素对茉莉花愈伤组织生长就有较强烈的抑制，10 mg/L的潮霉素有强烈的抑制作用，这从侧面说明了茉莉花愈伤组织中不存在潮霉素基因。从茉莉花转基因愈伤组织Hyg基因PCR检测中，其3次重复的电泳条带的亮度均比未转化的茉莉花愈伤组织强，初步说明重组质粒已经成功整合到茉莉花的基因组中。

3.3 瞬时表达与抗性愈伤组织筛选

本研究中，在农杆菌侵染烟草瞬时表达时，观察发现在侵染3 d后，GFP的亮度达到最大，而在一周后出现下降趋势，这与莫倩珍等[41]在研究烟草的快速高效表达中所发现的GFP基因表达趋势相似。在抗性愈伤组织的筛选上，可参考匡云波等[34]的研究，筛选时需要一段时间的恢复培养，并从低浓度的培养基进行筛选，可减少转化材料的褐变死亡，经过2轮的筛选后，假阳性逐渐被剔除，抗性愈伤的成活率平均可达66.67%左右。通过体式镜检测筛选后的抗性愈伤组织，发现愈伤组织块和单个细胞均发出强烈的绿色荧光。通过PCR检测目的基因、抗性基因和GFP基因，并结合GFP荧光蛋白检测，初步表明目的基因已整合到茉莉花愈伤组织基因组中，但有待进一步的分子生物学分析。

由于茉莉花愈伤组织再生植株的难题还未克服，未能获得转基因植株，目前相关的试验还在进一步研究中。但本试验成功构建了刺葡萄DFR基因的植物表达载体pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS，采用农杆菌介导法将该载体导入茉莉花愈伤组织中，经多轮筛选获得茉莉花转基因抗性愈伤组织。PCR检测结果初步证明，目的基因DFR已成功整合到宿主的基因组中，成功建立了茉莉花转基因愈伤组织遗传转化体系。本研究验证了花色苷合成相关基因转化茉莉花愈伤组织的可行性，为通过植物转基因技术创造丰富的茉莉花花色奠定了基础。

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