不同处理方式的妃子笑荔枝花穗ARF基因家族的表达分析

董晨 魏永赞 王弋 郑雪文 李伟才

摘 要 生长素反应因子（ARF）是一类可以结合在生长素应答基因启动子部位的转录因子，在植物的生长发育中起着至关重要的作用。为了研究荔枝ARF基因在不同花穗处理方式的表达情况，进而挖掘花穗发育过程中起主要作用的ARF关键基因，本研究利用课题前期基于转录组数据库鉴定出的LcARF基因家族，通过对妃子笑荔枝花穗分别进行疏花和喷施烯效唑处理，利用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术进一步研究LcARF基因家族在不同处理下的表达情况。结果表明：21 个荔枝ARF基因在疏花和烯效唑处理花穗发育过程中有明显不同的表达规律，且不同基因表达量有较大差异。因此推测，ARF家族成员在花穗发育过程中特定阶段起一定的作用，同时本研究也为深入探究ARF基因家族的功能奠定理论基础。

关键词 荔枝；ARF；qRT-PCR；基因表达

中图分类号 S667.1 文献标识码 A

Expression Analysis of Auxin Response Factor （ARF） Gene Family in Litchi chinesis Sonn.

DONG Chen， WEI Yongzan， WANG Yi， ZHENG Xuewen， LI Weicai*

Institute of South Subtropical Corp Research， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science/ Key Laboratory of Tropical Fruit Biology， Ministry of Agriculture， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract Auxin response factors （ARFs） are important transcription factors bound to the promoter site of the auxin response gene and play a crucial role in plant growth and development. The article was aimed to study the expression of litchi ARF in different treatment spikes， and to excavate important ARF genes. The study was based on the LcARF data identified by the transcriptome database. After the spakes of Feizixiao thinned and sprayed of uniconazole， the expression of ARF gene family under different treatments was studied by fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） technique. The results showed that the expression including expression level of ARF gene of 21 Litchi were significantly different in the process of spikes thinning and uniconazole treatment. Therefore， it is speculated that ARF gene family members play a certain role in the specific stage of flower spike development， and this study also laid a solid foundation for further exploration of the function of ARF gene family.

Key words litchi； ARF； qRT-PCR； gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.06.013

“妃子笑”荔枝植株营养生长旺盛，易成花，具有花穗长、花量大、花期长的特点，因大量营养消耗而导致坐果少，甚至出现有花无果的问题[1]。在生产上，常用机械短截疏花和化学调控技术来调控荔枝的坐果率。在花穗生长期对长的荔枝花穗进行短截，可明显地减少花量，增加雌花比例，提高花质和坐果率。烯效唑（Uniconazole）是一种新型植物生长延缓剂，具有高效低毒的特点，其作用机制是通过阻碍赤霉素（GA3）生物合成过程中贝壳杉烯到贝壳杉烯酸的氧化脱甲基化反应，使贝壳杉烯酸难以合成，导致赤霉素合成受阻，因而具有强烈的植物生长抑制活性。合适浓度的烯效唑和乙烯利处理‘妃子笑荔枝可明显抑制枝梢的生长，提高枝梢成花的比例、坐果率及雌雄花比率[2]。此外，在冬季荔枝成花诱导期喷施烯效唑可明显提高荔枝叶片的光合能力[3]。

植物激素在植物生长发育的各方面发挥着至关重要的作用，如侧根发育、顶端优势、胚胎形成和微管分化、开花坐果、果实成熟等[4]。生长素反应因子（ARFs）作为生长素信号通路中的重要转录因子，通过特异地与生长素响应基因启动子区域的生长素响应元件（AuxREs）TGTCNC结合，激活或抑制基因的表达[5]。ARF在植物体中以基因家族的形式存在，目前随着测序技术的飞速发展，越来越多的植物物种中的ARF基因家族在基因组学水平上得以鉴定，如拟南芥、水稻、玉米、谷子、大豆、番茄、黄瓜、菜心、香蕉、葡萄、甜橙、苹果、荔枝、甘蓝、大麦、毛竹等[6-21]。辣椒ARF基因家族各成员在不同发育时期不同组织中的表达量不同，具有一定的特异性，同时高盐胁迫可明显激活或抑制ARF基因家族的表达[22]。ARF在毛竹花器官中的差异表达模式分析表明，PheARF13、PheARF14和PheARF35在花芽、雌蕊和幼胚中高量表达，同时PheARF2、PheARF30、PheARF14、PheARF13、PheARF35、PheARF7、PheARF37、PheARF38在雌蕊和幼胚中高量表达，推测上述基因可能在花发育和种子发育中发挥着重要的作用[23]。杨树不同组织中ARF基因的表达与生长素相关性研究表明，生长素含量、ARF上調基因数目与基因表达信号量两两之间在夏秋季节中表现为高度相关，冬季对生长素响应因子信号量的影响最大[24]。本课题组前期基于转录组对荔枝ARF基因家族21个成员进行了鉴定及生物信息学分析[18]，鉴于此，本研究对‘妃子笑荔枝的花穗进行不同处理，通过qRT-PCR技术初步探索不同处理花穗发育过程中LcARF基因家族的表达变化规律，为深入了解ARF基因的功能及花穗发育过程中调控生长素的作用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验在广东省湛江市湖秀新村南亚热带作物研究所荔枝栽培示范园进行，供试品种为‘妃子笑荔枝。

1.2 方法

1.2.1 材料处理 选择树龄相同、长势相近的植株作为试验树。随机选择树冠大小和长势相似的‘妃子笑荔枝树9株，当花穗长度抽生至约18 cm时，进行如下3个处理和操作：（1）对照（CK），不做任何处理；（2）疏花（SH）处理，把花穗一次性短截至15 cm处；（3）烯效唑（Un）处理，用烯效唑（品牌：四川国光，有效成分含量5%）50 mg/L喷施，喷至叶面滴水；完全随机区组排列，單株小区，3次重复。定期观察，分别取对照及不同处理后0、7、14、28、42 d的花穗，液氮速冻后存放于-80 ℃冰箱中备用，用于RNA提取。

1.2.2 荔枝ARF基因家族荧光定量表达分析 荔枝总RNA提取采用植物RNA提取试剂盒（华越洋生物科技有限公司）。提取后的RNA样品取1 ?L检测RNA质量和浓度，然后利用M-MLV逆转录酶（TaKaRa ）合成cDNA第一链。选用本课题组筛选的LcActin为内参，根据转录组中注释的LcARF的核苷酸序列，利用在线软件Primer3plus设计荧光定量引物，通过blast分析引物的特异性，引物序列见表1，引物序列委托广州艾基生物技术有限公司合成。定量PCR分析采用SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）试剂盒，Roche 480 II定量PCR系统（瑞士），采用384孔板，qRT-PCR反应体系为10 ?L，其中cDNA 1 ?L（相当于25 ng总RNA），2 ?L基因特异性引物（10 ?mol/L），5 ?L 2×SYBR Premix ExTaq，用ddH2O补足10 ?L。反应条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性15 s，58 ℃火退30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。每个样品进行3次重复。采用2-ΔΔCT法计算目标基因相对表达量。

2 结果与分析

2.1 对照处理ARF基因的表达情况分析

对照LcARF基因家族在花穗发育不同时期的表达情况见图1，结果显示，LcARF基因在花穗不同发育阶段均有表达，但存在表达丰度的差异；另外不同的LcARF基因成员间表达量及趋势也存在差异。将21个LcARF表达量通过热图聚类分析发现，LcARF变化趋势大致可分为3类，LcARF1/2/8/3/5/10/4聚在一起，LcARF6/7/13/11/12/21/19聚在一起，LcARFLcARFLcARF9/18/14/15/16/20/17聚在一起（图2）。与0 d相比，7 d时，有15个LcARF基因家族成员表达上调，除LcARF15表达量是0 d的2倍以上，其他差异不显著。14 d时，表达上调的基因有LcARF6、LcARF7、LcARF10，其表达量为0 d的2倍以上。LcARF6、LcARF7、LcARF11、LcARF13的表达量在28 d时达到峰值，推测这些基因在该时期发挥着重要的作用。42 d时，有18个LcARF基因表达下调，占总数的86%。

2.2 疏花处理ARF基因的表达情况分析

疏花处理花穗不同发育时期LcARF基因表达情况见图3，结果显示，疏花处理花穗不同发育阶段LcARF均有表达，但表达变化差异不大。通过对表达量进行热图聚类分析，结果发现表达大致聚为3类（图4）。与疏花处理0 d相比，疏花处理7 d时，有16个LcARF基因家族成员表达上调，其中LcARF15的表达量差异在2倍以上，有7个LcARF表达下调，但下调幅度不大。疏花处理14 d时，有15个LcARF表达上调，其中表达量差异在2倍的分别为LcARF6和LcARF7。疏花处理28 d时，约62%的LcARF基因表达下调，下调幅度在2倍以上的有6个，分别为LcARF1/2/4/14/16/18；38%的LcARF基因表达上调，上调幅度在2倍以上的有1个，为LcARF7。疏花处理42 d时，有19个LcARF表达下调，占总数的91%，只有2个LcARF表达上调，且上调幅度不大。

2.3 烯效唑处理ARF基因的表达情况分析

烯效唑处理花穗不同发育阶段LcARF基因的表达分析见图5，表达聚类关系见图6。结果显示，与处理0 d相比，烯效唑处理7 d时，有77%的LcARF表达上调，其中上调幅度2倍以上的有2个，分别为LcARF12和LcARF15；下调的有5个，分别为LcARF4/5/6/7/19，占总数的23%。烯效唑处理14 d时，表达量的变化差异不大，17个LcARF显示表达上调，4个LcARF显示表达下调，但幅度均没有超过2倍。烯效唑处理28 d时，有12个LcARF表达下调，下调幅度2倍以上的有3个，分别为LcARF4/14/18；有9个LcARF表达上调，其中上调2倍以上的有1个，为LcARF17。烯效唑处理42 d时，有7个LcARF表达上调，分别为LcARF3/6/7/13/17/19/21，其中LcARF6/7/19上调幅度超过2倍；LcARF表达下调的有14个，其中LcARF14下调幅度最大。

3 讨论

荔枝花穗生长发育与植物内源激素关系密切，生长素作为最早发现的植物激素，其生理作用广泛，不仅影响细胞的分裂、伸长和分化，同时也影响营养器官和生殖器官的生长、成熟和衰老[25]。生

长素响应因子（ARF）是植物调控生长素响应基因表达的转录因子，在生长素的信号传导过程中处于中心位置，它可与生长素响应元件特异结合，促进或抑制基因的表达[4]。植物生长发育过程的各个方面（包括根、茎、花、果的发育）都受ARF的影响。

本研究通过对“妃子笑”荔枝不同处理花穗发育过程中LcARF基因家族的表达情况进行分析，结果表明，LcARF基因家族各成员间表达模式存在多样性，且相对表达量也存在差异，与前人对黄瓜和辣椒中ARF基因家族研究的结果一致[12-22]。大部分LcARF基因在荔枝花穗发育中表达量较低，只有部分LcARF基因表达量相对较高，如对照中的LcARF6/7/11/13，推测这些基因在荔枝花穗发育中发挥着重要的作用，这与大麦幼穗中ARF基因家族表达相似，均为低表达模式[20]。不同处理方式的花穗发育不同时期LcARF基因家族表达存在差异，推测LcARF基因家族不同成员间分别在不同的花穗发育时期发挥功能。另外不同处理后的花穗同一时期表达也存在差异，如LcARF1/2/4/5/6/7/8/10/11/13/15/16/17在疏花处理和烯效唑处理后花穗14 d的表达低于对照。LcARF1/2/4/5/8/9/10/15/16/17/18/20在不同处理后28 d表达较对照明显升高，烯效唑处理较疏花处理LcARF表达上调幅度要高；LcARF6/7/11/13/21在不同处理后28 d的表达明显下降，其中烯效唑处理较疏花处理LcARF表达量要低；LcARF1/2/6/7/8/9/12/13/14/15/16/18/19/20/21在烯效唑处理后42 d的表达量要高于对照，这与魏永赞等[26]研究荔枝花期发育过程内源生长素含量在烯效唑处理后42 d的结果相符。根据以上结果推测，处理后LcARF基因表达上调或下调对生长素的合成造成促进或抑制的作用，进而影响花穗的发育。

参考文献

[1] 呈定尧，张海岚. 妃子笑荔枝的特性[J]. 中国南方果树，1997（5）：26-27.

[2] 王令霞，曾丽萍，李新国. 不同浓度烯效唑和乙烯利对‘妃子笑荔枝成花效应的影响[J]. 中国园艺文摘，2012（8）：5-6.

[3] 李伟才. 成花诱导期喷施烯效唑和赤霉素对荔枝叶片叶绿素荧光特征的影响[J]. 热带作物学报，2014，35（12）：2 414-2 419.

[4] Woodward A W，Bartel B. Auxin：regulation，action，and interaction[J]. Annals of Botany，2005，95（5）：707.

[5] Hagen G，Guilfoyle T. Auxin-responsive gene expression：genes，promoters and regulatory factors[J]. Plant Molecular Biology，2002，49（3-4）：373.

[6] Okushima Y，Overvoorde P J，Arima K，et al. Functional genomic analysis of the AUXIN RESPONSE FACTOR gene family members in Arabidopsis thaliana：unique and overlapping functions of ARF7 and ARF19[J]. Plant Cell，2005，17（2）：444-463.

[7] Wang D，Al E. Genome-wide analysis of the auxin response factors （ARF） gene family in rice （Oryza sativa）[J]. Gene，2007，394（1-2）：13.

[8] Xing H，Pudake R N，Guo G，et al. Genome-wide identification and expression profiling of auxin response factor （ARF） gene family in maize[J]. Bmc Genomics，2011，12（1）：178.

[9] 赵 艳，瓮巧云，马海莲，等. 谷子ARF基因家族的鉴定与生物信息学分析[J]. 植物遗传资源学报，2016，17（3）：547-554.

[10] Van Ha C，Le D T，Nishiyama R，et al. The auxin response factor transcription factor family in soybean：genome-wide identification and expression analyses during development and water stress[J]. DNA Research，2013，20（5）：511-524.

[11] Wu J，Wang F，Cheng L，et al. Identification，isolation and expression analysis of auxin response factor （ARF） genes in Solanum lycopersicum[J]. Plant Cell Reports，2011，30（11）：2 059-2 073.

[12] 盛 慧，秦智伟，李文滨，等. 黄瓜生长素反应因子（ARF）家族鉴定及表达特异性分析[J]. 中国农业科学，2014，47（10）：1 985-1 994.

[13] Mun J H，Yu H J，Shin J Y，et al. Auxin response factor gene family in Brassica rapa：genomic organization，divergence，expression，and evolution[J]. Molecular Genetics & Genomics Mgg，2012，287（10）：765-784.

[14] Wei H，Jiao Z，Hou X，et al. The auxin response factor gene family in banana：genome-wide identification and expression analyses during development，ripening，and abiotic stress[J]. Frontiers in Plant Science，2015，6（742）：742.

[15] 袁华招，赵密珍，吴伟民，等. 葡萄生长素响应基因家族生物信息学鉴定和表达分析[J]. 遗传，2015，37（7）：720-730.

[16] Li S B，Ouyang W Z，Hou X J，et al. Genome-wide identification，isolation and expression analysis of auxin response factor （ARF） gene family in sweet orange （Citrus sinensis）[J]. Frontiers in Plant Science，2015，6：119.

[17] 李慧峰，冉 昆，何 平，等. 蘋果生长素响应因子（ARF）基因家族全基因组鉴定及表达分析[J]. 植物生理学报，2015（7）：1 045-1 054.

[18] 董 晨，魏永赞，王 弋，等. 基于转录组的荔枝ARF基因家族的鉴定及表达分析[J]. 热带作物学报，2017（8）：1 485-1 491.

[19] 卫聪聪，江 定，吴根堃，等. 甘蓝ARF基因家族的鉴定与生物信息学分析[J]. 北方园艺，2017（19）：16-24.

[20] 郭宝健，李 赢，袁泽宸，等. 大麦ARF基因家族的全基因组分析[J]. 麦类作物学报，2016，36（11）：1 426-1 432.

[21] 陈 磊，李晨曦，江 涛，等. 毛竹生长素响应因子基因家族的鉴定及其在竹笋发育中的表达[J]. 福建农林大学学报（自然科学版），2016，45（6）：662-667.

[22] 魏瑞敏，谢玲玲，欧阳娴，等. 辣椒ARF基因家族的鉴定与表达分析[J]. 西北植物学报，2017，37（6）：1 047-1 058.

[23] 程占超，侯 丹，马艳军，等. 毛竹生长素反应因子基因的生物信息学分析及差异表达[J]. 浙江农林大学学报，2017，34（4）：574-580.

[24] 李晓燕，陈雪梅，盖 颖. 杨树不同组织中ARF表达与生长素相关性研究[J]. 广东农业科学，2013，40（6）：134-137.

[25] 李 玲，潘瑞炽. 植物生长调节剂：原理与应用[M]. 广州：广东高等教育出版社，2007.

[26] 魏永赞，董 晨，王 弋，等. 烯效唑对荔枝花期发育过程内源激素的影响[J]. 热带作物学报，2017，38（7）：1 188-1 192.