哈茨木霉菌毒素与世高对桑葚核地杖菌抑菌活性的生物测定

余丹 黄宇 黄振

摘 要 核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）是桑葚白果病的主要病原菌之一，为害桑葚引起“白果病”。本文研究了哈茨木霉菌与世高单剂及混合物防治核地杖菌的潜力。研究结果表明：哈茨木霉的乙醇提取物（毒素）对核地杖菌菌丝生长和孢子萌发的抑制率分别为70%和80%以上，在室内条件下哈茨木霉毒素与世高对核地杖菌菌丝生长抑制的EC50分别为5.97、19.73 μg/mL。哈茨木霉与世高混合物对核地杖菌的抑制效果与混合物中两种单剂的含量有关，混合物T3（3.0+7.0）， T5（6.0+7.0） 和 T6（6.0+14.0）处理组对核地杖菌的抑制效果表现为增效作用；从对病原菌的抑制效果、使用成本与化学农药使用量等方面考虑，混合物T5是用于防治核地杖菌的最佳组合。本研究结果可为使用哈茨木霉毒素及其与世高联合防治桑葚白果病提供参考。

关键词 哈茨木霉；核地杖菌；世高；生物测定；孢子萌发抑制；菌丝生长抑制

中图分类号 S476 文献标识码 A

Abstract Scleromitrula shiraiana is one of the fungal pathogen that attacks mulberry fruits and causes disease named as “popcorn disease”. Trichoderma harzianum was evaluated for its efficiency to suppress plant pathogen S. shiraiana alone or combined with fungicide difenoconazole under laboratory conditions. The results showed that the ethanol extracts of T. harzianum caused high mycelial growth inhibition and germination inhibition of S. shiraiana， with the inhibition value up to 70% and 80%， respectively. The EC50 of the ethanol extracts of T. harzianum or difenoconazole in mycelial growth inhibition of S. shiraiana was 5.97 μg/mL or 19.73 μg/mL under laboratory condition， respectiviely. The level of synergism between the ethanol extract and difenoconazole was affected by the concentration of each component in the mixtures. The synergistic effects were observed in treatments T3（3.0+7.0）， T5（6.0+7.0） and T6（6.0+14.0）， respectively. The treatment T5（6.0+7.0） was determined as the best additive effects according to the inhibition， Me and Chi-square values， also the cost and reduce use of fungicides. The current research on the joint action of the ethanol extracts from T. harzianum with difenoconazole offered a promising， safe and effective alternative to fungicides in treatment against S. shiraiana， popcorn disease of mulberry.

Key words Trichoderma harzianum； Scleromitrula shiraiana； difenoconazole； bioassay； mycelial growth inhibition； germination inhibition

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.024

桑椹白果病是桑椹菌核病的俗稱，又称桑白果病，属真菌类病害，是桑果上的主要病害，其病原菌主要有6种：桑实杯盘菌（Ciboria shiraiana）、肉阜状杯盘菌（Ciboria carunculoides）、核地杖菌（Scleromitrula shiraiana）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、聚杯盘菌（Synciboria ningpoensis）、茜草生核地杖菌（Scleromitrula rubicola）[1-5]。核地杖菌等白果病病原菌主要侵染桑树的花，或在叶片的表面存活一段时间，但极少能侵染桑树的叶片和

茎[3-4]。白果病病原菌的孢子附着到桑椹的花器上，随后萌发、侵入子房内，入侵的菌丝在未成熟的桑果中迅速生长、大量增殖，最后菌丝在桑果中形成菌核，导致桑果呈白色、俗称“白果”。桑椹白果病在世界各地均有分布，我国的广东、浙江、江苏、安徽、上海、陕西等地均有该病发生为害的报道[1-2]。桑椹白果病轻则影响桑葚的产量与品质，重则致使桑果无法正常成熟收获，导致桑葚大面积减产，甚至颗粒无收，带病菌和农药残留的桑叶又严重威胁蚕茧的生产，直接影响桑椹加工产业与蚕业生产所需的原料来源，威胁到桑果产业的持续发展。桑椹白果病的防治目前主要采用农业综合防治和化学防治。国内外多年的田间实践表明，化学农药不能持续有效地控制白果病的大面积爆发危害[6-7]，同时会导致蚕桑产品的农药残留。开展桑椹白果病的生物防治有利于保护蚕桑产业的原料和产地的生态环境，采用以微生物源农药等为主的生物防治措施能持续、有效地控制白果病的发生为害。

木霉菌（Trichoderma sp.）广泛存在于不同类型的土壤中，是一种重要的植物病原生防真菌，其中哈茨木霉菌（T. harzianum）是白绢病、立枯病、疫病等多种植物病原菌的寄生菌和拮抗菌[8-9]。哈茨木霉菌主要通过重寄生作用、抗生作用、营养和空间的竞争、诱导植物产生抗性等多种方式来抑制植物病原真菌的为害[9-11]。哈茨木霉分泌的次生代谢产物可通过有效地破坏病原菌的细胞膜、使病原菌的原生质浓缩等抑制病原菌生长[11-13]。次级代谢产物中的小分子量、易挥发性非极性物质，如简单的芳香族化合物、丁烯酸内酯类和吡喃酮类聚酮化合物、挥发性的萜烯类、异腈等能在土壤中移动，可有效抑制土壤中的病原菌；另一类大分子、高分子量的极性物质，如木霉素（trichodermin）、peptaibols物质等[13-14]对白绢病、立枯病等有较强的抑制作用，其中木霉素对水稻纹枯病菌（Thanatephorus cucmeris）和黄瓜立枯病菌（Rhizoctonia solani）菌丝生长有显著的抑制作用[15-16]。尽管有关哈茨木霉菌代谢产物的杀菌机制及利用代谢产物防治水稻等作物病害方面已有研究报道，但利用哈茨木霉毒素防治桑椹白果病方面的研究未见报道。

在前期研究哈茨木霉毒素的过程中发现，该毒素能有效地抑制白果病病原菌的生长。因此，本研究主要评估哈茨木霉粗毒素及其与世高混合物对核地杖菌的孢子萌发、菌丝生长的抑制作用，为利用哈茨木霉菌及其代谢产物防治桑葚白果病提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株和试剂 供试菌株为哈茨木霉菌（T. harzianum）菌株Th-N5（保藏号为CCTCC No：M2016251），分离于广州地区被自然侵染的桑葚白果上。核地杖菌（S. shiraiana）Ss-05菌株分离于广州地区被自然侵染的桑葚白果上，保藏于华南农业大学农学院昆虫病原真菌实验室。核地杖菌的鉴定参考White等[17]的方法，以基因组DNA为模板用ITS1/ITS4为引物（引物序列为5-TCCGTAGGGTGAACCTGCGG-3 / 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）扩增其特异的ITS序列，在GenBank中比对序列以鉴定菌株。哈茨木霉菌和核地杖菌均在PDA培养基上分别于（26±1）、（20±1）℃培养，待产孢后用0.1%的吐温-80水溶液洗下孢子，用血球计数板将孢子液浓度分别调整到1×106、1×103个孢子/mL的备用。

试验所用的世高为市售的苯醚甲环唑原药（先正达投资有限公司生产）。

1.1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，加蒸馏水至1 000 mL。

固体发酵培养基： 麸皮 ： 玉米粉 = 3.5 ： 1（w/w），蛋白胨0.5%，磷酸二氢钾1.0%，硫酸铵2.0%，硫酸镁1.0%，氯化钙0.5%。

1.2 方法

1.2.1 哈茨木霉毒素的提取 将配制好的固体发酵培养基加水拌匀后装入三角瓶，在121 ℃下灭菌 30 min，冷却后每瓶接种 l～3 mL孢子液，（25±1）℃恒温培养 4 d后向固体发酵产物中分别加入石油醚、乙酸乙酯、甲醇和乙醇等4种有机溶剂，超声波处理 30 min，浸泡 2 d后过滤，获得分别由4种有机溶剂萃取的提取物（真菌毒素），将提取物减压浓缩获得哈茨木霉毒素。

1.2.2 哈茨木霉毒素抑制核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的生物测定 向PDA培养基中分别加入1.2.1中经4种有机溶剂提取的哈茨木霉毒素，制备成毒素浓度为10 ?g/mL的PDA固体平板培养基；将浓度为1×103个孢子/mL的核地杖菌孢子悬浮液30 ?L涂布于含毒素的PDA平板上，以不含粗毒素的PDA平板为对照，在20 ℃培养并观察产生的菌落，记录固体平板上的菌落数。每个处理各20个平板，每个处理3次重复。孢子萌发抑制率=[（对照区的菌落数 - 毒素处理区的菌落数） /对照区的菌落数] ×100%。将乙醇提取的毒素加入PDA培養基中配制成浓度为1.5、3、6、12、24 ?g/mL的固体平板，取30 ?L浓度为1×103孢子/mL的核地杖菌孢子悬浮液涂布于含不同浓度毒素的PDA平板上，在20 ℃培养、观察平板上的菌落，以不含毒素的PDA平板为对照，每日定时记录平板上长出的菌落数。每个处理3次重复。研究中所用核地杖菌孢子在不含毒素条件下的孢子萌发率均高于93%。

将核地杖菌的孢子悬浮液涂布于PDA平板上，在20 ℃培养至产生菌丝，选取菌丝生长均匀的地方打孔获得菌丝块（? 5 mm）。将乙醇提取的毒素加入PDA培养基中配制成浓度为1.5、3、6、12、24 ?g/mL的固体平板，在平板中央接入核地杖菌的菌丝块，以不含毒素的PDA平板为对照，在20 ℃培养。采用十字交叉法，每天定时测量菌落的直径。每个处理重复3次。菌丝生长抑制率= [（对照区菌落直径-处理区的菌落直径）/对照区菌落半径] ×100%。

1.2.3 世高抑制核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的生物测定 将世高加入PDA培养基中配制成浓度为3、6、12、24、48 ?g/mL的固体平板，采用1.2.2的方法测定世高对核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的抑制率，每个处理重复3次。

1.2.4 哈茨木霉毒素与世高的混合物抑制核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的生物测定 根据前面的测定结果，将哈茨木霉毒素与世高按不同比例混合，哈茨木霉毒素（乙醇提取物，?g/mL）与世高（?g/mL）的终浓度分别为T1（3+0） 、T2（6+0） 、T3（3+7） 、T4（3+14）、T5（6+7） 、T6（ 6+14）、T7 （0+7）、T8（0+14）。再将混合物加入PDA培养基中配制成固体平板，采用1.2.2 的方法测定不同浓度的混合物对核地杖菌孢子萌发和菌丝生长的抑制率，每个处理重复3次。

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