海洋弗氏链霉菌HNM0089抗真菌活性成分研究

陶琳 丛子文 周双清 黄东益 吴文嫱 许云 夏薇 张荣萍 黄小龙

摘 要 为了从海洋微生物中寻找农药先导化合物，本研究通过16S rRNA基因序列分析对具有抗真菌活性的海洋放线菌HNM0089的种属进行鉴定，并对其抗真菌的活性成分进行研究。结果表明：海洋放线菌HNM0089被鉴定为弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）。利用高分辨质谱、一维和二维核磁波谱技术，将其主要活性成分鉴定为星形孢菌素（Staurosporine）。该化合物对芒果炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌、薯蓣炭疽病菌和橡胶炭疽病菌均有抑制活性，具有开发成农用抗菌素的潜力。

关键词 海洋放线菌；弗氏链霉菌；抗真菌活性；星形孢菌素；农用抗菌素

中图分类号 Q939.92 文献标识码 A

Abstract A marine actinomycetes strain HNM0089 with antifungal activity was identified by 16s rRNA and its antifungal active ingredients was studied. The results showed that strain HNM0089 was identified as Streptomyces fradiae and the main active component was identified as staurosporine by the means of HRESI-MS， 1D-NMR， and 2D-NMR. The compound has inhibitory activity against Colletotrichum asianum， Magnaporthe grisea， Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4， Colletotrichum gloeosporioides Cg9， Colletotrichum gloeosporioides RC178 and has potential to be developed into agrochemical antibiotic.

Key words Marine actinomycete； Streptomyces fradiae； antifungal activity； staurosporine； agrochemical antibiotic

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.022

海洋微生物因其特殊的生存环境形成了独特的代谢途径、生存繁殖方式和适应机制，从而产生结构独特的次级代谢产物，现已成为了海洋活性天然产物的重要来源之一[1-3]。目前，从海洋微生物中发现了许多具有良好抗菌活性的化合物[4-5]，其中不少活性化合物在植物病虫害的生物防治中呈现出诱人的应用前景[6-8]。如海洋鲁特格斯链霉菌鼓浪屿亚种 （Streptomyces rugersensis subsp. gulangyunensis）产生的春日霉素类抗生素8510-I，对稻瘟病等植物病原菌具有极好的防治效果[9]。海洋细菌BAC-9912产生的宁康霉素，对立枯丝核菌、灰霉病菌、苹果轮纹病菌等植物致病菌具有很强的抑制作用[10]。因此，海洋微生物正成为寻找结构独特新型农用抗菌素的重要资源[11-12]。本实验室前期从海南文昌海域分离得到104株海洋放线菌，并进行了拮抗芒果采后炭疽病菌的活性筛选，结果发现海洋放线菌HNM0089对本实验室新报道的芒果炭疽病菌（Colletotrichum asianum）[13]具有良好的拮抗活性（图1）。为了明确海洋放线菌HNM0089的分类地位和抗菌活性成分，本研究对其16S rRNA基因序列进行分析，并对其活性代谢产物进行结构鉴定和活性评价，为进一步的产物研究和應用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 放线菌HMN0089菌株为本实验室从海南文昌海域采集的海绵样品中分离得到。芒果采后炭疽病菌（Colletotrichum asianum T0408）、水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4）、薯蓣炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides Cg9）和橡胶炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidesRC178）为本实验室保存菌株。

1.1.2 仪器与试剂 1H NMR、13C NMR及二维（HSQC、1H-1HCOSY、HMBC）相关核磁共振由Bruker DPX-400 Bruker DPX-600核磁共振仪测定；质谱测试使用Agilent公司的6210 TOF LC-MS仪器；ZF-I 型紫外分析仪。半制备高效液相层析：层析柱为250 mm×10 mm，粒径5 μm的Hypersil反相高效液相层析柱（美国Thermo Fisher Scientific），配备L-7110泵和L-7420 UV/Vis检测器的Hitachi HPLC系统。薄层层析用黄海硅胶TLC板（烟台江友硅胶开发有限公司）。凝胶层析所用填料为Sephadex LH-20（瑞典Pharmacia Biotech）。柱层析所用硅胶（200～300目）（青岛海洋化工厂）。常规提取分离用甲醇（MeOH）、乙酸乙酯（AcOEt）、石油醚（PE）、二氯甲烷（CH2Cl2）均为工业用化学纯产品，液相色谱甲醇（EtOH），液相色谱纯水，洗脱剂添加的酸为分析纯的三氟乙酸（TFA）。

1.1. 3 培养基 酵母膏麦芽膏培养基（ISP2）：酵母膏4 g，麦芽浸粉10 g，葡萄糖4 g，蒸馏水1 L，琼脂20 g，pH 7.3。

种子培养基：胰酪蛋白胨17.0 g，大豆蛋白胨 3.0 g，葡萄糖 2.5 g，氯化钠 5.0 g，磷酸氢二钾2.5 g， 蒸馏水1 L，pH 7.3。

发酵培养基K：可溶性淀粉25 g，黄豆粉15 g，酵母浸粉2 g，CaCO3 4 g，海盐27 g，纯水1 L，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株HNM0089的分子生物学鉴定 参照周双清等[14]的方法进行菌株DNA的提取、16S rRNA基因序列PCR扩增及序列测定，将获得的序列登录EzTaxon数据库（https：//www.ezbiocloud.net/）中作同源序列比对搜索，同时下载相关相似菌株序列，用Mega6.0软件构建系统发育树，确定其分类地位。

1.2.2 菌株的发酵 将斜面保存的菌种HMN0089接种到ISP2固体培养基平板上，在28 ℃培养箱中培养7 d。将活化的菌种HNM0089转接到装有200 mL种子培养基的1 L三角瓶中，于28 ℃，142 r/min摇床培养48 h，作为种子液。取10 mL种子液接种到装有200 mL发酵培养基K的1 L三角瓶中，共接种200瓶，于28 ℃，142 r/min 摇床培养10 d。

1.2.3 化合物的分离、纯化及结构鉴定 将1.2.2中所得的发酵液经3倍体积的乙酸乙酯溶剂萃取后减压旋蒸浓缩得到黄色粗提物6.0 g，该粗提物经200～300目硅胶柱色谱，以石油醚-二氯甲烷-甲醇（V：V：V，100：0：0，0：100：0，0：100：1，0：100：2，0：100：4，0：100：8，0：100：16，0：0：100）梯度洗脱，HPLC检测和活性分析后选取第5个和第6个流分，合并后经HPLC-C18反相制备（体积分数为90：10：0.15的MeOH-H2O-TFA洗脱，流速为2 mL/min）得到化合物TL-1（30 mg）；再通过HRESI-MS确定分子式和分子量，并确定1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HMQC等的化学结构。

1.2.4 抗植物病原真菌活性测定 采用微量稀释法对抗5种供试植物病原真菌的活性进行测定，以无菌DMSO为溶剂，将化合物TL-1配制成1 280 μg/mL的母液。然后采用倍比稀释法依次稀释得到浓度为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL的样品液。阳性对照放线菌酮的稀释方法同上。通过血球计数板计数将供试病原真菌的孢子制备成（2～4）×106个孢子/mL的菌液。取96孔细胞培养板，每孔分别加入100 μL的样品液和100 μL的孢子液（每种菌同时作空白对照），于28 ℃培养48 h后观察各孔中孢子的生长状况，以无菌生长的最低浓度为最小抑菌浓度（MIC值）。

2 结果与分析

2.1 菌种鉴定

采用PCR扩增得到菌株HNM0089的16S rRNA基因序列，有效片段長度为1 594 bp，提交GenBank数据库获得序列号MG020663。在EzTaxon数据库中进行有效种的序列相似性搜索，结果发现菌株HNM0089与链霉菌属标准菌株的同源性最高，其相似率在98.13%～100%之间。其中与之相似率最高的链霉菌为Streptomyces fradiae NBRC 3439T（相似率为100%），基于16S rRNA基因序列的系统发育分析显示菌株HNM0089与Streptomyces fradiae NBRC 3439T聚在同一分支，且遗传距离几乎为零（图2）。故鉴定菌株HNM0089为弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）。

2.2 化合物结构鉴定

从菌株HNM0089的代谢物中分离、纯化获得主产化合物TL-1。该化合物为黄绿色无定型粉末，正离子ESI-MS给出m/z 467.2098（[M+H]+），确定其分子式为C28H26N4O3，计算其不饱和度为18，紫外显示在291 nm处有尖锐特征吸收。1H NMR低场区给出2个活泼氢信号δH（9.02， 1H， d， 23.7），（8.65， 1H， s），7.2-9.4 ppm给出8个芳香氢信号，高场区给出12个氢信号；13C NMR中共28个碳信号，低场区包括1个羧基信号（δC 172.36），18个芳香碳信号，高场区包括4个次甲基信号，2个亚甲基信号，3个甲基信号。1H-1H COSY数据显示H-1和H-2相关，H-2和H-3相关，H-3和H-4相关，H-6和H-7相关，H-8和H-9相关，H-10和H-11相关，H-6和H-5相关，H-5和H-4相关，H-4a和H-4b相关，可将关联片段连出。HMBC数据显示H-2和C-4、C-13a相关，H-3和C-4a相关，H-4和C-2、C-4b、C-13a相关，H-6和C-4c、C-5、C-7、C-7a相关，H-7和C-4b、C-4c、C-5、C-7a相关，H-8和C-7b、C-7c相关，H-11和C-11a相关，这些信息确定该化合物有吲哚咔唑母核结构。此外H-2a和C-2、C-6相关，H-3和C-3a、C-4、C-5相关，H-3a和C-3相关，H-4b和C-4相关，H-5和C-3a相关，可确定糖环的结构，同时H-6和C-2、C-12a、C-12b相关，故可将母环和糖环连接起来，结构如图3。其核磁数据如表1 所示，通过文献比较，化合物TL-1与星形孢菌素的核磁数据一致[15]，因此确定化合物TL-1为星形孢菌素（staurosporine）。

2.3 抗植物病原真菌活性

由表2可知，化合物TL-1对芒果炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、薯蓣炭疽病菌、橡胶炭疽病菌和香蕉枯萎病菌均有显著的抑菌活性，最小抑菌浓度（MIC）值分别为0.125、8、8、8、8 μg/mL。其中对芒果炭疽病菌的抗菌活性优于阳性药放线菌酮，对香蕉枯萎病菌的抗菌活性低于放线菌酮，对其它3种病菌的抗菌活性与放线菌酮相当。

3 讨论

星形孢菌素（staurosporine）是Omura等[16]从土壤链霉菌Streptomyces staurosporeus AM-2282的发酵产物中分离的第1个吲哚咔唑类生物碱，显示有抗真菌的活性。Furasaki等[17]获得了星形孢菌素的单晶，并确定其化学结构。Tamaoki等[18]发现星形孢菌素具有极强的抗肿瘤活性，属于一类细胞膜渗透性良好的非选择性蛋白激酶抑制剂。从此该生物碱受到广泛关注，长期被作为一种抗肿瘤先导化合物进行研究[19-20]。但近年来，星形孢菌素的农药活性也逐渐被人们所发现。Park等[21]报道了星形孢菌素对Colletotrichum orbiculare、Phytophthora capsici、Rhizoctonia solani、Botrytis cinerea和Cladosporium cucumerinum等植物病原真菌具有相当强的抗性，其防治辣椒疫霉病的效果略低于甲霜灵。Cheng等[22]报道星形孢菌素对由水稻黄单胞菌引起的水稻白叶枯病具有良好的防治功效。此外，也有报道星形孢菌素还具有抗虫活性，对甜菜夜蛾具有较高杀虫活性[23-24]。本研究从海洋弗氏链霉菌HNM0089中分离到了星形孢菌素，并且发现其对芒果炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、香蕉枯萎病菌、薯蓣炭疽病菌和橡胶炭疽病菌均具有较强的抑制作用，结合文献报道，充分表明星形孢菌素具有较广的抗菌谱，具备开发成广谱农用抗菌素的潜力，但其抗菌机理还有待进一步研究。

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