瓜实蝇性别决定基因tra—2的克隆及表达分析

曾秀丹 龚治 彭正强 金启安 温海波 马光昌

摘 要 本研究对瓜实蝇Bactrocera cucurbitae Coquillett的性别决定基因tra-2的cDNA序列进行了克隆和分析。根据转录组数据库及序列同源性分析，分别克隆并获得瓜实蝇雌雄成虫tra-2的基因片段，利用生物信息软件对所得序列进行分析；采用qPCR技术，研究该基因在瓜实蝇不同发育阶段的表达情况。研究结果表明，瓜实蝇tra-2基因的cDNA序列共1 450 bp，无性别特异性，含753 bp的开放阅读框，共编码250个氨基酸。该基因在瓜实蝇不同发育阶段均有不同的表达量，瓜实蝇tra-2基因具有母体遗傳表达特性，在胚胎期的表达量较高，雌成虫表达量显著高于雄成虫。

关键词 瓜实蝇；性别决定；tra-2；qPCR

中图分类号 S433 文献标识码 A

Abstract In this paper， the sex determination gene tra-2 cDNA sequence of B. cucurbitae Coquillett was cloned and analyzed. According to the transcriptome database and sequence homology analysis， the male and female tra-2 gene fragments of the B. cucurbitae were cloned and analyzed by bioinformatics software. The qPCR technique was used to study the effects of different development stage of the expression of the situation. The results showed that the cDNA sequence of tra-2 gene of B. cucurbitae was 1 450 bp in length， without sex-specific transtript. The open reading frame of tra-2 was 753 bp in length， which encoding a polypeptide of 250 amino acids. tra-2 gene of B. cucurbitae had different expression levels in different developmental stages. It had maternal genetic effects with high expression in the embryonic period， and female adult expressed significantly more than male adult.

Key words melon fly； sex determination； tra-2； qPCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.020

瓜实蝇Bactrocera cucurbitae Coquillett，属双翅目Diptera，实蝇科Tephritidae，为中国进境植物检疫性有害生物[1]，属于钻蛀性害虫，危害葫芦科、茄科以及番木瓜、番石榴等120多种蔬菜和水果[2-7]，已在我国广东、广西、海南等地造成严重危害[5， 7-11]。瓜实蝇繁殖能力强，一年发生多代，世代重叠，以蛹或成虫越冬[12]，严重危害到各类果蔬的种植与生产[13-15]。

昆虫种类繁多，其性别决定机制复杂多样，了解昆虫的性别决定机制，有助于理解昆虫性别分化调控的过程，为人类有效控制害虫、高效利用益虫提供新的方向。昆虫的性别决定机制分为环境性别决定和遗传性别决定，目前环境性别决定的分子研究还较少，而对遗传性别决定的研究很多。在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中，性别决定是一个遗传级联式过程，主要涉及性染色体初始信号原件、sxl、tra、tra-2、dsx等基因[16-17]。明确昆虫的性别调控机制，结合RNAi技术，可人为调控昆虫的性别发育方向，用于昆虫不育技术的研究[18]。

本研究利用基因克隆技术，得到瓜实蝇性别决定基因tra-2的全长序列，并对氨基酸序列进行分析，利用荧光定量qPCR技术对该基因在瓜实蝇不同发育阶段的表达量进行了分析，为该基因日后的功能研究及释放携带显性致死基因的技术研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试昆虫：瓜实蝇为中国热带农业科学院环境与植物保护研究所入侵害虫课题组提供。成虫与幼虫均以人工饲料饲养，饲养条件为（27±0.5）℃，RH （50±5）%，光周期为14L ： 10D。

试剂：TransZol Up Plus RNA Kit、TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、pEASY?-T1 Cloning Kit、TransScript?Tip Green qPCR SuperMix等均购于北京全式金生物有限公司，Gel Exteaction Kit、Gel Mini Kit购于美国Omega Bio-Tek，无水乙醇购于西陇科学，三氯甲烷购于广州化学试剂厂，甘油购于Solarbio。

仪器：Centrifuge 5810R台式冷冻高速离心机、Thermo Scientific PCR仪、Thermo Scientific（Nanodrop 2000c）超微量紫外分光光度计、Applied Biosystems QuantStudio 6荧光定量PCR仪。

[8] 袁盛勇，孔 琼，李正跃，等. 瓜实蝇生物学特性研究[J]. 西北农业学报，2005，14（3）：38-40.

[9] 李志远. 浅谈瓜实蝇的发生规律与防治办法[J]. 农业技术与装备，2009（22）：42.

[10] 张全胜. 瓜实蝇的发生为害习性观察及其防治实践[J]. 中国植保导刊，2009，29（1）：24-25.

[11] 何卫蓉，彭建波，李泽森，等. 瓜实蝇为害特点及综合防治研究[J]. 中国园艺文摘，2012，28（8）：136-137.

[12] 蒋小龙，任丽卿，肖 枢，等. 瓜实蝇在云南生物学习性研究初报[J]. 植物检疫，2003，17（2）：74-76.

[13] 郑洁红，方加龙，郑 龙. 瓜实蝇生物学特性及综合防治技术[J]. 吉林蔬菜，2007（4）：33-34.

[14] 王红梅，贺申魁. 桂林地区瓜实蝇大量发生原因与防治对策[J]. 长江蔬菜，2008（4）：35-36.

[15] 邓亚评，邱 泉. 广西实蝇发生与监测调查[J]. 南方园艺，2008，19（1）：22-24.

[16] Erickson J W，Quintero J J. Indirect effects of ploidy suggest x chromosome dose，not the X：A ratio，signals sex in drosophila[J]. Plos Biology，2007，5（12）：2 821-2 830.

[17] Cline T W，Meyer B J. Vive la difference：males vs females in flies vs worms[J]. Annual Review of Genetics，1996，30（30）：637-702.

[18] Knipling E F. Possibilities of insect control or eradication through the use of sexually sterile males[J]. Journal of Economic Entomology，1955，48（4）：459-462.

[19] 李子玲，黄树生，王玉群，等. 瓜实蝇幼虫的分龄方法[J]. 植物检疫，2012，26（4）：42-44.

[20] Bell L R，Horabin J I，Schedl P，et al. Positive autoregulation of sex-lethal by alternative splicing maintains the female determined state in Drosophila[J]. Cell，1991，65（2）：229-239.

[21] Sánchez L. Sex-determining mechanisms in insects[J]. International Journal of Developmental Biology，2008，52（7）：837-56.

[22] Glisovic T，Bachorik J L，Yong J，et al. RNA‐binding proteins and post‐transcriptional gene regulation[J]. Febs Letters，2008，582（14）：1 977-1 986.

[23] Inga N，Miriam M，Martin B. The Am-tra2 gene is an essential regulator of female splice regulation at two levels of the sex determination hierarchy of the honeybee[J]. Genetics，2012，192（3）：1 015-1 026.

[24] Shukla J N，Palli S R. Tribolium castaneum Transformer-2 regulates sex determination and development in both males and females[J]. Insect Biochemistry & Molecular Biology，2013，43（12）：1 125-1 132.

[25] 郭利桃. 基于transformer2和doublesex级联互作的烟粉虱性别决定机制研究[D]. 北京：中国农业科学院，2016.

[26] 刘桂清. 桔小实蝇雌性特异胚胎致死品系的构建[D]. 北京：中国农业科学院，2015.

[27] Concha C，Scott M J. Sexual development in Lucilia cuprina （Diptera，Calliphoridae） is controlled by the transformer gene[J]. Genetics，2009，182（3）：785-798.

[28] Schetelig M F，Milano A，Saccone G，et al. Male only progeny in Anastrepha suspensa by RNAi-induced sex reversion of chromosomal females[J]. Insect Biochemistry & Molecular Biology，2012，42（1）：51-57.

[29] 劉桂清，武 强，和丹阳，等. 番石榴实蝇性别决定基因Bcotra和Bcotra-2的克隆、序列特征及表达分析[J]. 昆虫学报，2015，58（5）：516-525.

[30] Salvemini M，Robertson M，Aronson B，et al. Ceratitis capitata transformer-2 gene is required to establish and maintain the autoregulation of Cctra，the master gene for female sex determination[J]. International Journal of Developmental Biology，2009，53（1）：109-120.

[31] Burghardt G，Hediger M C，Moser M，et al. The transformer2 gene in Musca domestica is required for selecting and maintaining the female pathway of development[J]. Development Genes & Evolution，2005，215（4）：165-176.

[32] Sarno F，Ruiz M F，Eirín-López J M，et al. The gene transformer-2 of Anastrepha fruit flies （Diptera，Tephritidae） and its evolution in insects[J]. Bmc Evolutionary Biology，2010，10（1）：140.

[33] Amrein H，Hedley M L，Maniatis A T. The role of specific protein-RNA and protein-protein interactions in positive and negative control of pre-mRNA splicing by Transformer 2 [J]. Cell，1994，76（4）：735-746.

[34] Martín I，Ruiz M F，Sánchez L. The gene transformer-2 of Sciara （Diptera，Nematocera） and its effect on Drosophila sexual development[J]. Bmc Developmental Biology，2011，11（1）：19.

[35] Shen H，Kan J L，Green M R. Arginine-serine-rich domains bound at splicing enhancers contact the branchpoint to promote prespliceosome assembly[J]. Molecular Cell，2004，13（3）：367-376.

[36] Boggs R T，Gregor P，Idriss S，et al. Regulation of sexual differentiation in D. melanogaster via alternative splicing of RNA from the transformer gene[J]. Cell，1987，50（5）：739-747.

[37] Burtis K C，Baker B S. Drosophila doublesex gene controls somatic sexual differentiation by producing alternatively spliced mRNAs encoding related sex-specific polypeptides[J]. Cell，1989，56（6）：997-1 010.

[38] Hoshijima K，Inoue K，Higuchi I，et al. Control of doublesex alternative splicing by transformer and transformer-2 in Drosophila[J]. Science，1991，252 （5007）：833-836.

[39] Tian M，Maniatis T. A splicing enhancer complex controls alternative splicing of doublesex pre-mRNA[J]. Cell，1993，74（1）：105-114.

[40] 王慧超，朱 勇，夏慶友. 黑腹果蝇的性别控制[J]. 遗传，2003，25（1）：97-101.