中国水仙FOMT2基因及启动子的克隆与分析

张蒙 潘腾飞 余磊 杨华丽 潘东明

摘 要 为探究花色基因FOMT2在中国水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）类黄酮代谢途径中的功能作用，以期明确小分子化合物甲基化修饰在水仙类黄酮代谢中的作用，本研究以多花水仙“金盏银台” （Narcissus tazetta var. chinensis ‘jinzhanyintai）不同时期的花器官为材料，提取总RNA，采用RACE与RT-PCR结合的方法，克隆得到NtFOMT2基因的cDNA全长。结果表明：NtFOMT2基因的cDNA全长为1 404 bp，其中5′ UTR长度为33 bp， 3′ UTR长度为279 bp，开放阅读框为1 092 bp，共编码363个氨基酸。定量PCR分析结果表明，NtFOMT2基因表达水平在水仙花器官的不同时期差异很大，其表达模式表现为II>I>III>IV。此外，为分析水仙花色素基因的调节因素，以基因组DNA为模板，采用染色体步移法，成功克隆并分析NtFOMT2基因的5端调控序列。结果表明，NtFOMT2基因启动子序列除包含起始转录位点（transcription start site，TSS）TATA-box、CAAT增强子外，还包含多个顺式作用元件，如ACE、ATCT-motif、G-box、Sp1等多个光响应元件。此外，该启动子序列还含有MYB参与抗旱诱导的结合位点MBS元件、MYB转录因子结合位点等。

关键词 中国水仙；基因；克隆；FOMT；启动子；类黄酮

中图分类号 S682.2+1 文献标识码 A

Abstract In order to explore the function of FOMT2 gene in the flavonoid metabolic pathway in Narcissus tazetta. Var chinensis， and to clarify the function of the methylation modification of small molecule compounds in the flavonoid metabolism in Narcissus， the research used Narcissus tazetta. Var chinensis ‘Jinzhanyintai as the meterial to extract total RNA， and the full-length cDNA of NtFOMT2 was cloned with the method of RACE and RT. Results showed that the full length cDNA of NtFOMT2 was 1 404 bp， including a 33 bp 5′ UTR， a 279 bp 3′ UTR and a 1 092 bp ORF encoding 363 amino acids. The results of quantitative PCR showed that the expressions of NtFOMT2 in flower had big difference at different periods. The expression pattern was expressed as： II>I>III>IV. Besides， to analyze the regulating factors of pigment genes in N. tazetta， the regulation sequence of the 5 end of NtFOMT2 gene was cloned with the method of chromosome walking. Results showed that the promoter sequence of NtFOMT2 gene also included cis-acting elements such as ACE， ATCT-motif， G-box， Sp1 and many light responsive elements， besides necessary transcription starting site TATA-box and CAAT enhancer. Furthermore， this promoter sequence included a binding site MBS element participating in drought inducement of MYB， and a MBS binding site of MYB transcription factor and so on.

Keywords Narcissus tazetta var. chinensis； gene； cloning； FOMT； promoter； flavonoid

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.018

植物的O-甲基化（O-Methyltransferase，OMT）反應是类黄酮化合物分子修饰的一类重要反应，O-甲基化修饰赋予了类黄酮化合物新的生物学活性[1]。Joshi等[2]根据蛋白质的质量和二价离子对酶活的影响，将O-甲基转移酶（OMTs）分为咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶（CCoAOMT）和咖啡酸O-甲基转移酶（COMT）2种类型。I类O-甲基转移酶，即CCoAOMT，其蛋白质量在26～30 ku之间，其酶活性需要依赖二价金属离子，是合成木质素的关键酶；II类O-甲基转移酶，即COMT，其蛋白质量在40～43 ku之间，其催化活性不依赖于二价金属离子，可催化咖啡酸等苯丙素类化合物及一些类黄酮和生物碱类物质[2]。其中，FOMT被划分在II类O-甲基转移酶中[3]。

植物的O-甲基转移酶（OMTs）被认为参与了植物次生代谢产物的甲基化，尤其是苯丙烷类和类黄酮化合物[4]。在这些化合物的主干合成后，会发生各种各样的修饰反应。细胞色素 P450s（P450s）、糖基转移酶（GTs）和O -甲基转移酶（OMTs）已被证明参与了修饰反应，从而形成了丰富的类黄酮多样性[5]。目前，几个基因编码黄酮类O-甲基转移酶已经在分子和生物化学水平上被分离和表征，如长春花[6]、水稻[5]、染色麻花头[7]、拟南芥[8]、茶树[3]、银杏[9]、青稞[10]等植物中均克隆得到了OMT基因。本实验通过克隆并分析中国水仙NtFOMT2基因及其5端调控序列，根据前人报道的分类，该NtFOMT2基因属于第二类，常以二聚体形式存在，其催化活性不需要金属离子存在[11]。近年来，虽然已有许多关于FOMT基因克隆及其表达调控等分子生物学方面的研究，但仍有很多问题需要更深入、更细致的研究。

在前期研究中，柯毅湧[12]认为中国水仙花中未发现花青素存在，可能是因为类黄酮O-甲基转移酶（Flavonoid -O-Methyltransferase，FOMT）能特异识别芦丁为底物甲基化形成水仙苷，改变原物质化学活性，使其在结构上更稳定。水仙苷在盛花期前大量积累与花青素争夺共同的底物二氢槲皮素，从而抑制了花青素的合成[4]。本研究以此为切入点，采用RACE技术，成功分离出中国水仙FOMT2基因的全长cDNA，并对其进行生物信息学分析；采用染色体步移法（Genome Walking Kit），分离NtFOMT2的5端调控序列，对所得序列的顺式作用元件进行分析，从而进一步了解水仙FOMT的基因功能，为以后水仙体内类黄酮化合物的甲基化修饰的相关研究提供立论依据，以期明确小分子化合物甲基化修饰在水仙类黄酮代谢中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究以多花水仙‘金盏银台为材料。选用生长健壮、无病害、无残缺且大小一致的3年生水仙种球进行土培，下种时间为2016年11月5日。于水仙花芽4个不同生长时期取6个样品：白色的花芽、绿色的花芽、绿苞期的花瓣和副冠、盛花期的花瓣和副冠（表1）。将各样品分别处理好并做好标记，液氮速冻后放于-80℃冰箱备用。

大肠杆菌（Esherichia coli）DH5α感受态细胞、DNA纯化回收试剂盒均为天根公司产品；逆转录试剂盒（EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）购于全式金公司；啟动子克隆试剂盒Genome Walking Kit购自Takara公司。本文中所用引物均由华大基因合成，其名称及序列见表2。

1.2 方法

1.2.1 中国水仙FOMT2基因全长cDNA的克隆 参照Biospin?多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（Biospin Plant Total RNA Extraction Kit）的方法，提取不同时期的花器官混合样的RNA。以总RNA为模板，按照逆转录试剂盒说明书的具体操作合成cDNA。根据已有的多花水仙RNA-seq数据库筛选得到中国水仙FOMT基因序列，利用Primer Premier 5软件，设计出5′端RACE和3′端RACE引物（表1），将克隆得到的序列与原序列拼接后的全长设计ORF引物做验证，引物由华大基因合成。

以多花水仙cDNA为模板进行第1轮PCR扩增，总反应体系为25 μL：其中cDNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，10×Trans Taq-T Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，Trans Taq-T DNA Polymerase 0.2 μL，补ddH2O至总体积为25 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；35个循环的特异扩增（94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s）；72 ℃延伸10 min，4 ℃结束反应。第一轮PCR产物用ddH2O稀释500倍用做第2轮模板，反应体系与条件和第1轮PCR相同。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，回收目的条带，连接至pUCm-T载体，转化DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，将阳性克隆送至上海博尚生物技术有限公司测序。

利用DNAMAN软件，将克隆得到的5′端序列及3′端序列及转录组测得的部分编码序列进行cDNA全长的拼接，经Blast比对分析，将得到的FOMT基因命名为NtFOMT2。

1.2.2 中国水仙FOMT2基因全长cDNA的生物信息学分析 利用NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在线比对；利用DNAMAN8软件对其进行氨基酸序列比对；利用MEGA7软件构建系统进化树；利用ExPASy中的Protparam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）对其进行蛋白结构域预测。

1.2.3 NtFOMT2基因在水仙花芽不同发育时期的表达分析 采用Biospin?多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取水仙花器官发育不同时期和不同部位的总RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent kit（Perfect Real Time）试剂盒的方法合成cDNA。PCR反应体系和程序参照SYBR? Premix Ex TaqTM（TliRNaseH Plus）在耶拿qTOWER2.2荧光定量仪上进行检测，引物见表1，每个样品设3个生物重复和3个技术重复。以actin为内参基因，利用2-△△CT法对水仙FOMT2在水仙花器官不同发育时期和部位的表达进行分析。

1.2.4 NtFOMT2基因5′端调控序列的克隆与分析 采用CTAB法[13]对中国水仙种球中花芽基因组DNA进行提取，参照Takara公司Genome Walking Kit说明书的步骤，根据所获得的NtFOMT2基因全长序列设计3条巢式引物（表2）。以多花水仙基因组DNA为模板，按照说明书的步骤，以PCR扩增NtFOMT2基因的5′端调控序列，电泳检测PCR产物并回收目的条带，按照pEASY-Blunt Cloning Kit说明书取4 μL纯化产物与1 μL载体进行连接反应，室温反应20 min。连接产物转到T1感受态细胞，转化完后对阳性克隆进行检测。用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线对测序结果进行启动子作用元件分析。

2 结果与分析

2.1 中国水仙FOMT2基因克隆及其生物信息学分析

以多花水仙的花芽cDNA为模板，用FOMT2引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测目的条带的清晰度和完整性（图1），结果获得的特异条带与预测的基因片段大小相同，初步确定为目的基因片段。胶回收产物连接、转化后送测序，将已有的转录组数据中NtFOMT2基因中部分序列与获得的序列进行拼接，得到中国水仙NtFOMT2基因的cDNA全长。在该全长设计ORF引物，以PCR扩增进行验证。

由图2可知，NtFOMT2基因的cDNA全长为1 404 bp，其中5′ UTR长度为33 bp，3′ UTR长度为279 bp，ORF为1 092 bp，共编码363个氨基酸。

2.2 中国水仙NtFOMT2基因的序列分析

将得到的NtFOMT2基因全长在NCBI上进行Blast比对，结果显示，NtFOMT2基因与中国水仙黄花水仙（Narcissus tazetta var.chinensis ‘huanghuashuixian caffeic acid O-methyltransferase-like protein）咖啡酸O-甲基转移酶（COMT， KC455936.1）的相似度为97%，与铁皮石斛（Dendrobium catenatum，XM_020829677.1）的同源性为69%，与油棕（Elaeis guineensis，XM_010936612.2）的caffeic acid 3-O-methyltransferase和tricetin 3'，4'，5'-O-trimethyltransferase-like（XM_010936611.2）同源性均为70%。并且与海枣（Phoenix uctylifera，XM_008790507.2）、烟草、大豆、蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris，XM_020723616.1）等植物的COMT基因进行了比对。基本理化性质预测分析结果表明，NtFOMT2基因编码363个氨基酸，蛋白分子量为40.00 ku，原子组成为C1790H2810N464O527S23，理论等电点为5.19，负电荷的氨基酸残基数为49，正电荷的氨基酸残基数为36，不稳定系数为28.56。上述结果均表明克隆得到的序列为中国水仙FOMT2基因。

选取18种植物的OMT氨基酸序列与NtFOMT2氨基酸序列构建NJ系统进化树。结果显示，OMT系统发育树分为两大类，其中中国水仙“金盏银台”与“黄花水仙”、“黄花水仙2号”的OMT归为第二类，与第一类中的胡桃、垂枝桦、茶树、海枣、大叶杨、胡萝卜、油棕等植物的OMTs在进化上有明显区分，这表明不同科属植物之间的OMT氨基酸序列呈现明显差异，以100%的bootstrap支持度形成一个分支，在此分支下，不同科属植物种类形成一个分类群（图3）。

2.3 中國水仙FOMT2基因的定量表达分析

由图4可知，NtFOMT2基因在佛焰总苞形成初期、佛焰总苞形成中期、绿苞期的花瓣和副冠、盛花期的花瓣和副冠中均有表达，但不同发育时期表达水平存在较大差异。其中佛焰总苞形成中期表达量最高，佛焰总苞形成初期表达量居中，绿苞期和盛花期均下降。

2.4 中国水仙FOMT2基因的5端序列及其分析

将得到的5端调控序列提交到在线软件PlantCare上进行分析，结果表明，中国水仙FOMT2基因启动子序列除包含必需的起始转录位点（transcription start site，TSS）TATA-box、CAAT增强子外，还有ATCT-motif、ACE、G-box、Sp1等多个光响应元件（图5）。此外，该启动子序列还含有真菌诱导子响应元件Box-W1、表达分生组织相关元件CAT-box、参与茉莉酸甲酯响应的顺式调控元件CGTCA-motif、TGACG-motif及MYB参与抗旱诱导的结合位点MBS元件，并且还发现一个MYB转录因子结合位点MBS。同时对NtFOMT2基因启动子顺式调控元件的功能进行推测，结果见表3。

3 讨论

植物OMT家族因底物多样性形成庞大的甲基转移酶家族，类黄酮OMTs通过争夺黄酮羟基中的质子转移甲基而改变底物结构，并改变底物的理化性质和功能[10]。目前关于植物OMTs cDNA的克隆及其结构、功能的研究较多，但极少有从启动子及其所受转录调控机制着手研究的。本研究成功克隆了中国水仙“金盏银台”FOMT2基因的全长，通过Blast比对并用MEGA软件建树分析可知，“金盏银台”FOMT2基因与“黄花水仙”有很高的同源性。但在感官上可知，“金盏银台”为白色花瓣，黄色副冠；“黄花水仙”的花瓣、副冠均为黄色系，但副冠的黄色较深。因此说明花色的形成是一个复杂的过程，并且合成物质受多种酶的共同协调作用。从水仙花色类黄酮生物合成途径可知，甲基化反应是类黄酮化合物分子修饰的一类重要反应，O-甲基化修饰赋予了类黄酮化合物新的生物学活性。因此，研究FOMT基因在水仙中不同时期不同器官的表达量，将有助于揭示水仙花色形成相关基因表达之间的动态关系，进而为水仙花色研究提供新思路。

从表达特性看，NtFOMT2基因在佛焰总苞形成期表达量迅速增加，在绿苞期和盛花期的花瓣和副冠中表达量均降低，说明该基因的表达为下调模式，这种表达模式与其同源基因银杏FOMT和葡萄AOMT的表达模式相似。已有研究结果发现银杏叶片中该基因表达模式为春季幼叶>秋季老叶>夏季成熟叶，其表达也为下调模式[9]。葡萄AOMT属可诱导表达基因，其表达产物AOMT可能参与了花青素甲基化反应。以此类推，NtFOMT2基因表达产物NtFOMT2可能参与了类黄酮甲基化反应。

本研究得到的NtFOMT2基因启动子序列中存在1个MYB参与抗旱诱导的结合位点MBS元件，该元件可能受MYB调控参与了干旱胁迫信号的响应及转录调控机制；并发现1个MYB转录因子结合位点MBS，进一步说明NtFOMT2基因的表达可能受MYB转录因子的调控。此外，该启动子序列还含有多个光响应元件，如ACE、ATCT-motif、G-box、Sp1等，通过这些元件可推测NtFOMT2基因可能参与光合反应或受光信号因子调控。类黄酮物质的生物合成过程相当复杂，其生物代谢途径受到大量关键酶基因的直接影响，而这些酶基因的表达又受到相应转录因子的调控[14]。基因启动子区转录调控元件的识别是研究基因转录调控机制进而构建基因表达调控的关键，生物信息学方法是解决该类问题的重要手段[15]。目前，人们已在植物中找到了很多调控黄酮类此生代谢的转录因子基因。已从拟南芥[16]、矮牵牛[17-18]、长春花[19]等许多植物中分离和鉴定了控制次生代谢的多种转录因子。Debora等[20]发现在葡萄的生长发育过程中，花青素甲基化受干旱胁迫诱导，影响了花青素的积累，并通过实验得出OMT在干旱胁迫下可能增强葡萄中花青素的甲基化活性的结论。Gao等[21]研究发现MYB转录因子可能通过抑制花青素的合成，参与了植物花色的积累过程。杨文杰等[22]从大豆中克隆出2个MYB基因；通过酵母系统检测结果表明，GmMYBZ2基因可能也参与植物类黄酮合成的调控[23]。综上所述，本研究分离出中国水仙NtFOMT2基因的cDNA全长及5端调控序列，并且分析了其包含的相关顺式作用元件在胁迫响应和不同信号分子诱导中的调控功能，为今后分离出与之相关调控序列特异结合的转录因子提供了依据，以期明确小分子化合物甲基化修饰在水仙类黄酮代谢中的作用，同时也为阐明调控该基因表达的信号转导途径提供重要资料。

参考文献

[1] Muzac I，Wang J，Anzellotti D，et al. Functional expression of an Arabidopsis cDNA clone encoding a flavonol 3′-O-methyltransferase and characterization of the gene product[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，2000，375（2）：385-388.

[2] Joshi C P，Chiang V L. Conserved sequence motifs in plant S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferases[J]. Plant Molecular Biology，1998，37（4）：663-674.

[3] 马成英，吕海鹏，林 智，等. 茶树类黄酮O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析[J]. 中国农业科学，2013，46（2）：325-333.

[4] Poór M，Zrínyi Z，K?szegi T. Structure related effects of flavonoid aglycones on cell cycle progression of HepG2 cells：Metabolic activation of fisetin and quercetin by catechol-O-methyltransferase （COMT）[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy，2016，83（5）：998-1005.

[5] Kim B，Lee Y，Hur H，et al. Flavonoid 3′-O-methyltransferase from rice：cDNA cloning，characterization and functional expression[J]. Phytochemistry，2006，67（4）：387-394.

[6] Cacace S，Schroder G，Wehinger E，et al. A flavonol O-methyltransferase from Catharanthus roseus performing two sequential methylations[J]. Phytochemistry，2003，62（2）：127-137.

[7] Huang T S. Partial purification，kinetic analysis，and amino acid sequence information of a flavonol 3-O-methyltransferase from Serratula tinctoria[J]. Plant Physiology，2004，134（4）：1 366-1 376.

[8] Yang H，Ahn J，Ibrahim R K，et al. The three-dimensional structure of Arabidopsis thaliana O-methyltransferase predicted by homology-based modelling[J]. Journal of Molecular Graphics and Modelling，2004，23（1）：77-87.

[9] 張传丽，陈 鹏，仲月明，等. 银杏类黄酮O-甲基转移酶基因的克隆与表达分析[J]. 园艺学报，2012，39（2）：355-362.

[10] 牟 利，张鹍飞，李 鹏，等. 青稞F7-OMT基因的克隆及原核表达分析[J]. 麦类作物学报，2016，36（1）：18-26.

[11] Kopycki J G，Rauh D，Chumanevich A A，et al. Biochemical and structural analysis of substrate promiscuity in plant mg2+-dependent O-methyltransferases[J]. Journal of Molecular Biology，2008，378（1）：154-164.

[12] 柯毅湧. 中国水仙花类黄酮合成途径研究[D]. 福州：福建农林大学，2016.

[13] 蓝碧秀，王 凛，吴子恺，等. 利用改良CTAB法快速小量提取微胚乳玉米基因组DNA[J]. 基因组学与应用生物学，2015，34（1）：190-194.

[14] 邢 文，金晓玲. 调控植物类黄酮生物合成的MYB转录因子研究进展[J]. 分子植物育种，2015，13（3）：689-696.

[15] 李广平，张长青，章 镇. 梅PGIP基因的启动子克隆及生物信息学分析[J]. 西北植物学报，2010，30（5）：883-887.

[16] Sagasser M，Lu G H，Hahlbrock K，et al. A-thaliana TRANSPARENT TESTA 1 is involved in seed coat development and defines the WIP subfamily of plant zinc finger proteins[J]. Genes & Development，2002，16（1）：138-149.

[17] Spelt C，Quattrocchio F，Mol J N，et al. anthocyanin1 of petunia encodes a basic helix-loop-helix protein that directly activates transcription of structural anthocyanin genes.[J]. The Plant Cell，2000，12（9）：1 619-1 632.

[18] de Vetten N，Quattrocchio F，Mol J，et al. The an11 locus controlling flower pigmentation in petunia encodes a novel WD-repeat protein conserved in yeast，plants，and animals[J]. Genes & Development，1997，11（11）：1 422-1 434.

[19] Menke F L，Champion A，Kijne J W，et al. A novel jasmonate- and elicitor-responsive element in the periwinkle seconury metabolite biosynthetic gene Strinteracts with a jasmonate- and elicitor-inducible AP2-domain transcription factor，ORCA2[J]. The EMBO Journal，1999，18（16）：4 455-4 463.

[20] Gioruno D，Provenzano S，Ferrandino A，et al. Characterization of a multifunctional caffeoyl-CoA O-methyltransferase activated in grape berries upon drought stress[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2016，101（1）：23-32.

[21] Gao J，Shen X，Zhang Z，et al. The myb transcription factor MdMYB6 suppresses anthocyanin biosynthesis in transgenic Arabidopsis[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture （PCTOC），2011，106（2）：235-242.

[22] 楊文杰，杜 海，方 芳，等. 大豆两个MYB转录因子基因的克隆及表达分析[J]. 中国农业科学，2008，41（4）：961-970.

[23] 刘守梅，孙玉强，王慧中. 植物MYB转录因子研究[J]. 杭州师范大学学报（自然科学版），2012，11（2）：146-150.