不同形态氮素配比对水培叶用莴苣生长与总有机酸变化的影响

周相助 严逸男 刘明月 尚春雨 谢圣爽 吴章洪 华炜辉 林义章 钟凤林

摘 要 为明晰不同氮素形态对叶用莴苣生长情况与总有机酸含量的影响，本研究对叶用莴苣总有机酸提取条件进行优化并获得了最优的提取条件，以研究不同氮素形态配比对叶用莴苣生长情况及总有机酸积累的影响。结果表明，叶用莴苣总有机酸最佳提取工艺条件为：提取时间45 min，提取温度75 ℃，乙醇浓度75%，料液比1∶30，在此条件下提取得率最大，为0.18%。各因素对叶用莴苣总有机酸提取得率的影响程度为：料液比=乙醇浓度>提取温度>提取时间。不同氮素形态处理叶用莴苣生长情况表明一定的铵硝配施更有利于叶用莴苣的生长，其中以NO3-N∶NH4+-N=7∶3长势最好，全铵态氮生长最差。不同氮素形态对总有机酸的影响结果为当NO3-N∶NH4+-N=0∶10时，叶片和根系中分泌的总有机酸含量最高，NO3-N∶NH4+-N=0∶10时最低。本研究表明，一定浓度铵硝配施较全硝态氮或全铵态氮更有利于植物的生长，铵态氮利于总有机酸的积累，但不利于植物生长。

关键词 叶用莴苣；总有机酸；氮素形态；优化

中图分类号 S31 文献标识码 A

Abstract To clarify the effect of different nitrogen forms on the growth of Lactuca sativa and the content of total organic acids， in this experiment， the conditions of extracting total organic acid from L. sativa L. were optimized and the optimum condition was obtained. The optimum conditions of extracting total organic acid in L. sativa L. were as follows： extraction time 45 min， extraction temperature 75 ℃， ethanol concentration 75%， and material liquid ratio 1∶30. Under the conditions， the extraction efficiency was 0.18%. The influence of each factor on the extraction rate of total organic acid was as follow： the material liquid ratio = ethanol concentration > extraction temperature > extraction time. The growth of L. sativa L. with different nitrogen morphological treatments showed that it was more conducive to the growth with certain ratio of ammonium nitrogen and nitrate nitrogen. When NO3-N∶NH4+-N=7∶3， the growth was best； when the whole ammonium nitrogen was applied， the growth was worst. The effects of different nitrogen forms on total organic acids showed that when NO3-N∶NH4+-N=0∶10， the content of total organic acid secreted in the leaves and roots was the highest； when NO3-N∶NH4+-N=0∶10， the content was lowest. The results of the study showed that it was more beneficial to the growth of plant when certain ratio of ammonium nitrogen and nitrate nitrogen was applied， rather than the whole ammonium nitrogen or the whole nitrate nitrogen. Ammonium nitrogen was beneficial to the accumulation of total organic acids， but it was not conducive to the growth of plant.

Keywords Lactuca sativa L.； total organic acid； nitrogen form； optimization

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.010

葉用莴苣（Lactuca sativa L.）属菊科莴苣属植物，以嫩梢、嫩叶为产品器官，俗称油麦菜。其叶片富含维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素C和P元素，含有相当丰富的铁盐、钙盐和磷盐，有较高的营养价值[1]。叶用莴苣具有复种指数高、清洁无污染、病虫害少等优点，是水培绿叶蔬菜中生产面积较大的一类蔬菜[2]。另外，叶用莴苣属于喜氮植物，特别是硝态氮，为提高其生长速率和产量，生产上大都采用大量施用氮肥来提高产量，该法虽短期内能提高农作物产量，但长期施用不仅达不到增产的目的，反而会降低氮肥利用率、造成肥料浪费、威胁人体健康[3]。植物吸收的氮素形态主要是NO3-N、NH4+-N，氮素形态对蔬菜的生长发育、产量、品质等都有较大影响[4-6]。氮素形态影响作物的氮素代谢、光合机构、矿质元素的吸收等。另外，氮素通过影响植物体内的氮代谢从而对植物的有机酸代谢进行调控，而有机酸类物质对植物生长、矿质元素的吸收等有着重要的作用，这些生理代谢最终会影响到植物的生长形态和生物量。目前，王晋等[7-9]已对不同铵硝配比下叶用莴苣的光合特性、氮同化途径以及相关品质指标进行了一系列研究，结果均在NO3-N∶NH4+-N=7∶3时各方面表现良好，但关于其生长情况以及对总有机酸影响未研究。综上所述，本试验研究不同氮素形态配比对叶用莴苣总有机酸、生长情况的影响，旨在找出满足叶用莴苣生长较佳的氮素形态配比，期望能在指导农业施肥、提高作物氮利用率、降低生产成本和环境污染等方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为叶用莴苣品种‘全年油麦菜，于福建农林大学园艺学院设施温室中种植。采用水培培养，营养液配备借鉴华南农业大学的叶菜类B营养液配方[10]，设置5个不同氮素形态配比处理，其NO3-N∶NH4+-N分别为10∶0（T1）、7∶3（T2）、5∶5（T3）、3∶7（T4）、0∶10（T5）。叶用莴苣幼苗长至2片真叶，移植于各处理的栽培管道，用对应铵硝配比的营养液栽培。移植后缓苗4 d，然后开始每4 d取样1次，分别记为0、4、8、12、16 d，共5次，用液氮充分冷冻后置于–80 ℃冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 生长情况的测定 叶用莴苣移植缓苗4 d后，开始第1次取样，每隔4 d取样一次，分别记为0、4、8、12、16 d，共5次，进行形态学拍照，分别取地上部和地下部样品烘干，进行根系和地上部干重的测定，采用叶绿素计（SPAD-502 Plus浙江托普云农科技股份有限公司）测定其相对叶绿素含量，均做3次重复。

1.2.2 标准曲线的绘制及总有机酸含量的测定 没食子酸标准曲线的绘制参考陈琦等[11]的方法，在最大吸收波长730 nm下分别测定不同浓度的没食子酸的吸光值。以没食子酸的含量C对吸光度A进行回归，得出回归方程为：A=1.784 4C+0.000 3和相关系数R2=0.999 6。按回归方程计算总有机酸的含量，计算公式如下：

总有机酸提取得率（mg/g）

其中，C为根据标准曲线计算出的总有机酸含量（mg），VT为提取液总体积（mL），N为稀释倍数，m为叶用莴苣鲜重，VS为测定时样品提取液体积（mL）。

1.2.3 提取工艺单因素及正交试验 叶用莴苣叶片冻样研磨后分别对提取时间、温度、料液比、乙醇浓度4个单因素进行优化，各因素水平設计如表1所示。

1.3 数据处理

用DPS（7.05）软件对试验数据进行方差分析，用LSD法进行差异显著性分析，显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 不同氮素形态配比对叶用莴苣生长影响

不同氮素形态配比对叶用莴苣生长影响不同，由图1可知，T1处理叶片较狭长，T2随着处理天数的增加，叶片数增加较快且品型端正，T5处理植株在整个处理期间生长较其它处理缓

慢。在尖叶莴苣生长前期，随着铵态氮含量的增加，植株越绿，但是在生长16 d时，T4出现边缘黄化现象，而T5处理在12 d时植株就表现出缺绿变黄症状，在处理16 d时更是表现脉间失绿且在叶片内部出现褐色斑点，且根系颜色暗黄，中毒现象较为明显。结果表明，一定的铵硝配比利于尖叶莴苣的形态构成、植株生长，全硝态氮会导致植株地上部地下部生长不均衡，地上部生长细长，根系稀疏；高浓度的铵态氮以及全铵态氮会抑制叶用莴苣的生长，在植株生长后期表现出缺绿症状，且会导致植株表现出中毒现象。

由图2可知，从T1～T5处理，根系长度逐渐变短，其中T1处理根系表现出长而稀，T2根系表现为密而较长，T3、T4、T5根系长势不自然，表现出稀而短且有瘤状突起、轻触易碎。在处理16 d时，随着铵态氮比例的增加，根系颜色逐渐变黄，其中T1根系长而白，T2、T3表现出较长且密，而T4、T5根系颜色较黄且长势不自然，有明显中毒现象。结果表明，硝态氮利于根系的伸长，一定的铵硝配比利于根系密度的增加，而高浓度的铵态氮不利于根系伸长且在生长后期亦表现出铵中毒现象，从而影响到植物对水分和矿质元素的吸收，进而抑制植株地上部分的生长。

由图3（A、B、C）可知，随着铵态氮含量的增加，叶用莴苣地上部干重和根系干重均呈先上升后下降的趋势，其重量依次为T2>T3>T1>T4>T5，表明T2、T3更利于叶用莴苣生物量的积累。根冠比T1、T3、T4呈先下降后上升的趋势，T2呈逐渐上升最后不变趋势，T5大致呈逐渐上升的趋势，表明T1、T3、T4、T5在生长后期地上部地下部生长不均衡，T2处理地上部、地下部生长较为稳定。结果表明，一定的铵硝配比较单一供硝态氮或铵态氮更利于叶用莴苣生物量的积累、平衡地上部和地下部生长。由图3-D可知，T1叶绿素含量呈先上升后下降趋势，且T1总叶绿素含量始终低于其它加铵态氮的处理，T2、T3、T4处理叶绿素含量始终保持上升的趋势，但在16 d时，T5叶绿素含量逐渐下降，这可能是因为在生长后期，植株根系铵中毒，阻碍了水分和矿质元素的吸收，从而影响到叶绿素的合成。结果表明，一定的铵硝配比更利于植物叶绿素含量的积累。

2.2 叶用莴苣总有机酸提取单因素试验

由图4-A可知，随着提取时间的增加，叶用莴苣总有机酸提取得率呈先上升后下降趋势。提取得率在30 min达到最大值，为0.15 mg/g，其中30 min处理下的提取得率与45、60、75 min差异不显著，但显著高于15 min。结果表明，合理的提取时间有利于叶用莴苣总有机酸的浸出，提取时间过短或者过长，反而会降低叶用莴苣总有机酸的提取得率。因此，提取时间为30 min最有利于叶用莴苣总有机酸含量的提取。由图4-B可知，随着提取温度的递增，提取得率在90 ℃达到最大值，为0.14 mg/g，100 ℃次之，为0.11 mg/g，45 ℃最低，为0.09 mg/g。结果表明，合理的提取温度有利于叶用莴苣总有机酸的浸出，提取温度过高或者过低，反而会降低叶用莴苣总有机酸的提取得率。因此，提取时间为90 ℃最有利于叶用莴苣总有机酸含量的提取。由图4-C可知，随着料液比的递增，叶用莴苣总有机酸提取得率呈起伏变化的趋势，提取得率在1∶20处达到较大值，为0.09 mg/g，1∶25处稍有下降，为0.08 mg/g，但在1∶30处达到最大值，为0.13 mg/g。其中1∶30处理下的提取得率与1∶10、1∶15、1∶20、1∶25差异均显著，但是1∶20与1∶25差异不显著。试验结果表明，合理的料液比有利于叶用莴苣总有机酸的浸出，料液比过小会降低叶用莴苣总有机酸的提取得率。考虑到最大提取得率的结果，料液比为1：30时最有利于叶用莴苣总有机酸含量的提取。由图4-D可知，随着乙醇浓度的递增，叶用莴苣总有机酸提取得率呈持续上升的趋势。提取得率在100%达到最大值，为0.16 mg/g；75%次之，为0.15 mg/g；纯水最低，为0.047 mg/g；其中75%处理下的提取得率与100%差异不显著，与0%、25%、50%差异均显著。研究结果表明，合理的乙醇浓度有利于叶用莴苣总有机酸的浸出，乙醇浓度过低会降低叶用莴苣总有机酸的提取得率。从实际情况考虑，乙醇沸点较低易蒸腾挥发，并且乙醇浓度越高试验成本也会相应增加，因此，乙醇浓度为75%时最有利于叶用莴苣总有机酸含量的提取。

2.3 叶用莴苣总有机酸提取正交试验

通过单因素试验结果分析，以提取时间、提取温度、乙醇浓度、料液比4个因素作为参考指标，采用4因素3水平的正交试验进行进一步分析，其正交试验因素水平如表2所示。

利用水提法进行叶用莴苣总有机酸提取的正交试验结果如表3所示，第四组即A2B1C2D3水平组合即提取时间45 min、提取温度75 ℃、乙醇浓度75%、料液比1∶30提取得率最大，提取得率为0.18%。由极差R可知，各单因素对叶用莴苣总有机酸提取得率的影响程度为：料液比=乙醇浓度>提取温度>提取时间。本次正交试验是建立在单因素试验结果的基础上进行的。根据单因素试验結果确定提取时间、提取温度、乙醇浓度以及料液比为4因素，再对各因素进行3水平的操作进而确定出9种组合。正交试验结果与4个单因素试验结果存在不同，根据单因素结果可知提取条件分别为提取时间为30 min、提取温度为90 ℃、乙醇浓度为75%、料液比为1∶30时提取得率最大。

2.4 加样回收率试验

精密称取0.5 g的叶用莴苣，按第2.3节提取方法进行提取，精密加入没食子酸对照品4 mg，重复6次按第1.2.2节进行总有机酸含量的测定。结果表明，没食子酸标准品的回收率在96.000%～ 101.500%，RSD为1.96%，表明该方法对有效成分的影响符合要求（表4）。

2.5 不同氮素形态配比下叶用莴苣总有机酸含量

由图5-A可知，不同氮素形态配比下叶用莴苣叶片不同时期总有机酸含量呈先下降后上升的趋势，且随着NH4+-N含量的增加而增加，T1（NO3-N∶NH4+-N=10∶0）含量最低，T5（NO3-N∶NH4+-N=0∶10）含量最高，T3、T4、T5处理差异不显著，与T1、T2存在显著性差异；

由图5-B可知，不同氮素形态配比下叶用莴苣根系不同时期总有机酸含量变化趋势与地上部大致相似，均为T1处理含量最低，T5最高。结果表明NH4+更有利于叶用莴苣叶片和根系总有机酸的分泌。另外，总有机酸含量总是叶片高于根系，表明总有机酸的合成部位可能主要集中在叶片中。

3 讨论

NO3-N、NH4+-N是植物生长发育可利用的两种主要氮素形态，它们对植物的生长有着不同的生理代谢[12]。Fan等[13]和Tang等[14]研究表明，NO3-N、NH4+-N、酰胺态氮及铵硝配施可在一定程度上促进植物的生长，延长根长、增加茎分蘖数以及促进干物质的积累。越来越多的研究表明，供应混合的氮源比供应单一NH4+-N或NO3-N更有利于植物的生长，单供NH4+-N植物多表现为叶面积较小、叶比重较大、根冠比变小、根系变短、侧根减小、颜色加深，且较高浓度的NH4+-N会产生铵盐毒害现象，表现为叶片边缘坏死、叶片枯黄褪绿[15]。Zhang等[16]的研究表明，NO3-N会增加侧根的长度及数量，而Celisarámburo等[17]的研究却认为NO3-N会抑制主根的生长。本试验研究结果表明，NO3-N利于根系的伸长，一定的铵硝配比有利于根系密度的增加以及总叶绿素的积累，而高浓度的NH4+-N不利于根系伸长，在生长后期表现出铵中毒现象，植株矮小且叶片出现坏死斑点，与Zhang等[16]的结果较一致，而与Celisarámburo等[17]的结果相反，可能与所研究的植物种类或研究条件不同有关。

本研究中，水提法提取叶用莴苣总有机酸的最佳工艺条件为：提取时间45 min、温度75 ℃、乙醇浓度75%、料液比1∶30时提取得率最大，为0.18%。各单因素对叶用莴苣总有机酸提取得率的影响程度为：料液比=乙醇浓度>提取温度>提取时间。目前，总有机酸含量的测定方法大都采用电位滴定法[18]、HPLC法[19]，也有极少研究采用紫外分光光度法[20]。本研究优化的叶用莴苣总有机酸的最佳提取工艺具有用时短、操作简单、提取效率较高等优点，采用该优化条件提取不同氮素形态中叶用莴苣总有机酸，结果表明，NO3-N∶NH4+-N=0∶10时叶片和根系分泌的总有机酸含量最高，NO3-N∶NH4+-N=10∶0时最低。综上结果表明，NH4+-N利于总有机酸的分泌，但不利于植物的生长；而关于氮素是否通过影响植物体内的氮代谢从而对植物的有机酸代谢进行调控，李灿雯等[21]和王树起等[22]研究均认为是氮素影响了总有机酸的积累，从而影响到植物对K+、Ca2+的吸收，最终抑制植物的生长。然而，科学施用氮肥，受氮肥种类、配比及栽培方式等方面的影响，本研究仍需开展氮肥对作物矿质元素的吸收、氮代谢与有机酸类物质的相关性、反施有机酸类物质并观察其对作物生长的直接作用等方面的研究。

综上研究表明，NO3-N有利于根系的伸长，一定的铵硝配比（NO3-N∶NH4+-N=7∶3）有利于根系密度的增加，而高浓度的NH4+-N不利于根系伸长。根据本课题组以往对不同铵硝配比下尖叶莴苣的光合特性、氮同化途径以及相关品质指标的研究结果表明，在NO3-N∶NH4+-N=7∶3时各方面表现良好，结合本研究对其生长情况的研究结果，推荐NO3-N∶NH4+-N=7∶3作为叶用莴苣生长的最佳氮素配比。

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