2个荔枝品种体胚发生过程中几种抗氧化酶与多胺氧化酶活性的变化

吉训志 李焕苓 王果 王家保

摘 要 以‘新球蜜荔和‘大丁香2個荔枝品种胚性愈伤组织为材料，研究了‘新球蜜荔（XQTD）和‘大丁香（DDXTD）接种在TD（MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L TDZ+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 mL/L 椰汁+60 g/L 蔗糖+10 g/L 琼脂）培养基与‘新球蜜荔接种在TX（MS+0.1 mg/L NAA+5 mg/L ZT+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 ml/L椰汁+60 g/L蔗糖+10 g/L琼脂）培养基（XQTX）上各培养物体胚发生过程中抗氧化酶与多胺氧化酶活性变化。结果表明：体胚发生过程中，三者的可溶性蛋白含量变化都呈单峰曲线，峰值出现在第6天，在前12 d的培养中，XQTD高于XQTX，仅在第9天，DDXTD高于XQTD。三者的丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性都变化平缓且差异不大。三者的过氧化物酶（POD）活性变化都呈单峰曲线，XQTD的峰值出现在第9天，其余出现在第12天，体胚发生过程中DDXTD最高。XQTD和XQTX的过氧化氢酶（CAT）活性都呈先降后升趋势，而DDXTD只是后期下降。三者的多胺氧化酶（PAO）活性变化都呈先降后升趋势，在前15 d的培养中，XQTX和DDXTD都低于XQTD，且DDXTD在前6 d里基本无变化。培养物中可溶性蛋白含量、POD和PAO活性变化可能与‘新球蜜荔及‘大丁香的体胚发生效率差异有关。

关键词 荔枝；体胚发生；抗氧化物酶；多胺氧化酶

中图分类号 S667.1 文献标识码 A

Abstract Changes of several antioxidant enzymes and polyamine oxidase activity in embryonic callus of litchi cultivars ‘Xinqiumili and ‘Dadingxiang were studied during the somatic embryogenesis induced on different induction media.The results showed that there was one peak curve of soluble protein content in both the embryonic callus of ‘Dadingxaing （DDXTD） and ‘Xingqiumili（XQTD）inoculated on TD medium （MS + 0.1 mg/L NAA + 0.5 mg/L TDZ + 0.1 g/L inositol + 0.4 g/L LH + 100 ml/L coconut juice + 60 g/L sucrose + 10 g/L agar）， and the embryonic callus of ‘Xingqiumili（XQTX）inoculated on TX medium （MS + 0.1 mg/L NAA + 5 mg/L ZT + 0.1 g/L inositol + 0.4 g/L LH + 100 ml/L coconut juice + 60 g/L sucrose + 10 g/L agar）， with the peak occurring on the 6th day after inoculation （th day）. The content of soluble protein in XQTD was higher than that in XQTX from 6th to 12th day， while DDXTD had higher soluble protein content on 9th day than XQTD. The malondialdehyde （MDA） content and the superoxide dismutase （SOD） activity in XQTX， XQTD and DDXTD had gentle variations and little differences. During the process of somatic embryogenesis， the changes of peroxidase （POD） activity in XQTX， XQTD and DDXTD showed a single peak curve， with the peak of XQTD appeared on the 9th day， the rest appeared on the 12th day. The highest POD activity was in DDXTD， and the lowest was on XQTD. The catalase （CAT） activity in XQTD and XQTX increased after decrease during somatic embryogenesis， while the catalase （CAT） activity in DDXTD only decreased in the later period. The polyamine oxidase （PAO） activity in XQTD， XQTX and DDXTD all increased after a slight decrease in the early 6 days. PAO activity in XQTD was higher both than that in XQTX from the 6th to 15th day， and than that in DDXTD from the 0 to 15th day. The soluble protein content， POD activity and PAO activity may be related to the different frequency of the somatic embryogenesis of 'Xinqiumili' and 'Dadingxiang'.

Key words litchi （Litchi chinensis Sonn.）； somatic embryogenesis； antioxidant enzyme； polyamine oxidase

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.011

荔枝离体再生技术的研究已获得一定的进展，在少数品种上已获得再生植株[1]，但体胚诱导困难、成苗率低仍是制约荔枝再生技术发展的瓶颈[2-3]，其机制尚不清楚。植物细胞在正常的生命代谢过程中都会产生活性氧自由基，其对植物细胞具有破坏作用，为保证正常的生命活动，必须保持活性氧自由基在低水平。抗氧化相关酶类与消除活性氧作用相关，活性酶大部分本质上是蛋白质，丙二醛与细胞损伤有关，而多胺含量与体胚发生密切相关，多胺氧化酶与多胺代谢又具有联系[4]，了解这些生化活性的变化将为揭示体胚发生的分子机制奠定基础[5]。前人对橡胶树体胚发生的研究中发现超氧化物歧化酶（SOD）活性和可溶性蛋白含量变化与体胚发生密切相关，丙二醛含量（MDA）与体胚发生关系不大[6]；在对石刁柏体胚发生的研究中发现，多胺氧化酶（PAO）在体胚发生过程中酶活性下降，过氧化氢酶（CAT）呈相反的变化趋势[7]；在对荔枝转基因原生质体再生的胚性愈伤组织细胞系[8]、楸树[9]和樱桃番茄叶[10]的体胚发生研究中发现，过氧化物酶（POD）活性在愈伤组织旺盛生长到球形胚期间不断上升，达到最高点后开始下降，表明POD对体胚的分化有促进作用。对于荔枝体胚发生中生理生化变化的报道尚少，未见有关荔枝品种间体胚诱导效率差异生理生化机制的报道。笔者们在前期对2个荔枝品种利用胚性愈伤组织进行体胚诱导的研究中发现，‘新球蜜荔荔枝品种在TD培养基（MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L TDZ+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 mL/L椰汁+60 g/L蔗糖+10 g/L琼脂）上培养第9 d开始出现体胚，在TX培养基（MS+0.1 mg/L NAA+5 mg/L ZT+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 mL/L椰汁+60 g/L蔗糖+10 g/L琼脂）上培养第12天开始出现体胚，两者都在培养15 d以后体胚大量出现，而‘大丁香荔枝品种在TD培养基上培养第15天后少量出现体胚。本研究拟对比2个荔枝品种上述体胚发生过程中培养物的抗氧化物酶与多胺氧化酶变化，探讨这些变化与体胚发生的关系，为提高不同荔枝品种的体胚发生效率提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 材料

挑取‘新球蜜荔和‘大丁香2個荔枝品种的胚性愈伤组织接种在TD培养基（MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L TDZ+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 mL/L椰汁+60 g/L蔗糖+10 g/L琼脂）上，同时取上述相同的‘新球蜜荔胚性愈伤组织接种在TX培养基（MS+0.1 mg/L NAA+5 mg/L ZT+0.1 g/L肌醇+0.4 g/L水解乳蛋白（LH）+100 mL/L椰汁+60 g/L蔗糖+10 g/L琼脂）上，接种当天记为0 d，每3 d取1次样，3次重复，取样时间为0、3、6、9、12、15、18 d，每次取样后立即将样品放置-80 ℃下进行冷冻保存备用。

1.2 方法

1.2.1 粗提液的制备 分别选取-80 ℃下保存‘新球蜜荔和‘大丁香2个荔枝品种0、6、9、12、15、18 d不同取样时间的培养材料各0.1 g（0 d与3 d的培养材料无差异，未选取），加入1.0 mL的含0.2 g聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVPP）磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH7.8，PBS）和2颗直径为0.2 cm的小钢球在高通量样品研磨仪（TissuelyserⅡ），20 Hz，60 s进行粉碎，10 000 r/min，4 ℃离心10 min取上清液，上清液即粗酶液，用于酶活性和可溶性蛋白含量的测定。

取上述同样材料加入1.0 mL的100 g/L三氯乙酸（TCA）溶液，研磨粉碎，10 000 r/min，4 ℃离心10 min取上清液，上清液用于丙二醛含量的测定。

1.2.2 生理指标的测定 参照曹建康等[11]的测定方法，采用考马斯亮蓝比色法测定可溶性蛋白含量；硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定丙二醛（MDA）含量；愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性；过氧化氢还原法测定过氧化氢酶（CAT）活性；NBT光还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性；通过测定多胺氧化生成过氧化氢的含量来测定多胺氧化酶（PAO）活性[12-14]。

1.3 数据处理

将得到的数据结果用 WPS office 2016软件进行处理，生成图表并分析。

2 结果与分析

2.1 可溶性蛋白含量变化

在培养过程中，‘新球蜜荔在TD和TX上培养物的可溶性蛋白含量变化规律相似，都呈单峰曲线，峰值出现在第6天，在TD上可溶性蛋白峰值高于在TX上。在第9～12天，在TD和TX上可溶性蛋白含量都是先下降再稍微上升，在TD上高于在TX上。在第15～18天，两者可溶性蛋白含量都不断下降，2种培养基上培养物的可溶性蛋白含量差异不大（图1-A）。

在TD培养基上，‘大丁香和‘新球蜜荔培养物的可溶性蛋白含量也都呈单峰曲线，都在第6天上升达到最高点，随后下降。第9天‘大丁香高于‘新球蜜荔，其余时间点二者无明显差异（图1-B）。

2.2 MDA含量和POD、SOD、CAT活性变化

2.2.1 丙二醛含量的变化 在培养过程中，‘新球蜜荔在TD和TX上培养物的丙二醛含量变化平缓，且几乎无差异（图2-A）。在TD培养基上，‘大丁香和‘新球蜜荔培养物的丙二醛含量也变化平缓，且无差异（图2-B）。

2.2.2 POD活性的变化 在培养过程中，‘新球蜜荔在TD和TX上培养物的POD活性变化规律相似，都呈单峰曲线，在TD上，峰值出现在第9天，且变化幅度较小，在TX上，峰值出现在第12天，变化幅度较大。从第6～15天，接种在TX上培养物的POD活性均高于接种在TD培养基上的（图3-A）。

在TD培养基上，‘大丁香培养物在培养过程中POD活性都高于‘新球蜜荔。‘大丁香培养物POD活性峰值出现在第12天，而‘新球蜜荔出现在第9天。‘大丁香培养物POD活性变化幅度远大于‘新球蜜荔（图3-B）。

2.2.3 SOD活性的变化 在培养过程中，‘新球蜜荔在TD和TX上培养物SOD活性都变化不大，但都保持着较高的活性。在第6～12天，‘新球蜜荔在TX上SOD活性高于在TD上，在第15～18天，在TD上SOD活性上升，在TX上SOD活性基本不变（图4-A）。

在TD培养基上，‘大丁香和‘新球蜜荔培养物SOD活性基本相当。‘大丁香SOD活性从0 d培养到第9天时上升达到最高点。随后下降，在第15～18天期间略有上升，但变动不大，与‘新球蜜荔无明显差异（图4-B）。

2.2.4 CAT活性的变化 在培养过程中，‘新球蜜荔在TD和TX上培养物CAT活性变化相似（图5-A）。在第0～6天，‘新球蜜荔在TD和TX上CAT活性都从最高点下降；第9天，在TD和TX上CAT活性都上升，但在TX上CAT活性高于在TD上；第12天，两者的CAT活性相当；第15天，在TX上CAT活性上升，而在TD上CAT活性下降达到最低点；第18天，在TX和TD上CAT活性都上升，但是前者高于后者。

在TD培养基上，‘大丁香培养物CAT活性变化整体呈下降趋势（图5-B）。在第0～6天，‘大丁香CAT活性基本无变化；第9天，‘大丁香CAT活性下降；第12天，‘大丁香与‘新球蜜荔CAT活性相似；第15天，‘大丁香CAT酶活性稍微上升；第18天，‘大丁香CAT活性急剧下降达到最低点，并低于‘新球蜜荔。

2.3 PAO活性的变化

在培养过程中，‘新球蜜荔在TD和TX上培养物的PAO活性变化都呈先降后上的趋势。在第0～6天，‘新球蜜荔在TD和TX上PAO活性都下降达到最低点，在TD上PAO活性高于在TX上，在第9～18天，在TD上PAO活性不断上升，在第18天达到最高点，在TX上PAO活性在第9～12天期间出现下降后也不断上升，也在第18天达到最高点（图6-A）。

在TD培养基上，‘大丁香培養物的初始PAO活性低于‘新球蜜荔，且在第18天以前，‘大丁香培养物的PAO活性都低于‘新球蜜荔。在第0～6天，‘大丁香与‘新球蜜荔PAO活性都下降，但‘大丁香的下降幅度低于‘新球蜜荔（图6-B）。

3 讨论

体细胞胚胎发生不仅是细胞形态建成，还涉及到生物大分子与酶化学等生理变化的过程[15-17]。在对‘新球蜜荔和‘大丁香2个荔枝品种的体胚发生过程中细胞学研究发现，‘新球蜜荔在TD培养基上培养9 d出现球形胚结构，第12天‘新球蜜荔在TD和TX培养基上都出现心形胚结构，在第15天和第18天都出现鱼雷形胚结构，且体胚大量出现。而‘大丁香在TD培养基上第15天时出现心形胚结构，第18天出现畸形胚结构，未出现大量体胚（待发表）。

在对这2个荔枝品种体胚发生过程中可溶性蛋白含量变化的研究中发现，在培养前期可溶性蛋白大量生成，‘新球蜜荔在TD培养基上体胚发生较早，并高于在TX培养基上的可溶性蛋白含量，两者随后开始下降。‘新球蜜荔在体胚开始出现的时间段，第9～12天期间的可溶性蛋白有一个积累回升的过程。这可能为体胚分化提供物质基础有关，与大蒜[18]在球形胚时期可溶性蛋白积累回升的研究结果相似。‘大丁香的可溶性蛋白在大量生成后不断下降流失，而可溶性蛋白未积累回升可能是导致体胚发生效率低的缘故。

培养过程中丙二醛含量（MDA）在2个荔枝品种中都处于很低的水平，表明在体胚发生过程中细胞受到活性氧的损伤较小。邢更妹等[19]研究发现植物体胚发生往往伴随着大量的活性氧产生，而一套高效的抗氧化系统能够保证体胚发生的正常进行，而使愈伤组织不会褐化死亡。过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）这3种抗氧化物酶具有较强清除活性氧的活性。在对‘新球蜜荔和‘大丁香体胚发生过程中这3种抗氧化物酶的研究中发现，POD在2个体胚发生效率不同的荔枝品种中酶活性差异较大，‘大丁香的POD活性远大于‘新球蜜荔，但‘新球蜜荔在体胚出现时间点，第9天与第12天都有POD活性峰值，而‘新球蜜荔和‘大丁香的SOD活性和CAT活性的变化规律与酶活性都差异不大，表明POD可能在体胚诱导过程中的作用更大。前人在对樱桃番茄[10]、人参[20]和大蒜[18]等的体胚发生的研究中发现，POD在体胚发生初期酶活性较高，POD在愈伤组织形成和体胚发育过程中酶活性升高，与本文研究结果一致。枸杞[21]、橡胶[6]和楸树[9]等的体胚发生研究显示，SOD在体胚发生过程中酶活性上升，在心形胚时期达到最高，与本文研究结果不一致，在本研究中SOD在体胚发生过程中都保持着较高的活性，表明SOD可能起基础保障作用。

在对‘新球蜜荔和‘大丁香的多胺氧化酶（PAO）活性变化规律研究中发现，‘新球蜜荔在第6天体胚发生时期，PAO活性大幅度降低，而‘大丁香无明显变化。多胺具有调节细胞生长和分化的作用，而PAO主要参与多胺分解代谢的调节活动[4]。前人在对石刁柏体胚发生的研究中发现PAO在体胚发生时期酶活性下降，与本文研究结果一致。在对荔枝合子胚发育的研究中发现，正常发育的胚珠在胚胎发育各个阶段的多胺含量都高于败育胚珠[22]。多胺可能在荔枝体胚发生过程中也起到重要作用，而这尚待进一步研究。

综上所述，可溶性蛋白含量、POD活性与PAO活性的变化，可能与不同培养条件诱导‘新球蜜荔的体胚发生早晚有关，也与‘新球蜜荔和‘大丁香的体胚发生效率差异相关。这为进一步研究荔枝体胚发生机制奠定了一定基础。

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