方波脉冲电转化酿酒酵母条件优化

胡明瑜 白文钦 潘晓雪 吴红 雷开荣

摘   要   方波脉冲对细胞电击转化的效果优于指数波脉冲。目前，酵母电转化常使用的是指数波脉冲，方波脉冲转化酵母的研究较少。为了优化方波脉冲转化酿酒酵母的条件，在1M山梨醇的电击缓冲体系中，以酿酒酵母营养缺陷型菌株EGY48为试验对象，使用方波脉冲转化质粒，通过统计酵母转化子数量，摸索和優化脉冲电压、脉冲次数和脉冲宽度的参数。试验结果显示，脉冲电压为500 V，脉冲宽度为15 ms，脉冲次数为1～3次时，方波脉冲转化酵母的效率较高。

关键词   方波脉冲;电转化;酿酒酵母;脉冲电压;脉冲宽度;脉冲次数

中图分类号：Q78    文献标志码：A    DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.34.017

方波是一种特殊的脉冲波，在峰值和低值之间瞬时变换。在对细胞进行方波电击时，脉冲电压瞬间达到峰值，维持一定的脉冲宽度后，瞬间降为低值，完成一次方波脉冲。已有大量研究表明，方波脉冲对细胞电击转化的效果好于指数衰减脉冲波。Takahashi等[1]对人白血病细胞K562进行基因电击转化，在β-半乳糖苷酶基因瞬时表达试验中，指数衰减波的转化率仅为1%，方波脉冲的转化率约为5%，而且细胞存活率更高;在新霉素抗性基因的细胞转化试验中，方波脉冲转化率接近1%，指数衰减波转化率不到0.01%。Liu等[2]用荧光标记的寡聚核苷酸，比较方波脉冲和指数波脉冲转化不同造血细胞的效果，方波脉冲转染效率更高，而且转入的寡聚核苷酸的活性更强。Vierra等[3]对玻璃海鞘（Ciona intestinalis）的受精卵进行电击转化，两种脉冲方式转化的LacZ基因在胚中瞬时表达效率接近，而方波脉冲转化后，正常发育胚的比例更高。此外，利用方波脉冲对血吸虫、猪胎成纤维细胞等成功转入RNA、DNA等生物大分子[4-5]。这些研究表明方波脉冲电转化效率高、适应性广，具有较广泛的用途。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是真核单细胞微生物，基于酿酒酵母开发的分析技术已广泛应用于不同生物的生长发育、病原与寄主的致病/抗病机理、生物与环境/激素信号应答等多方面的研究。酿酒酵母易于培养，可作为生物反应器大规模生产难以化学合成的生物活性大分子。例如，Callari等[6]在酿酒酵母中分别表达细菌中的ssf基因簇和不同植物来源的酯酰辅酶A连接酶基因，用于合成具有抗癌、抗炎、抗痉挛等活性的当归酯化物前体当归酰辅酶A。优化的生物反应器以丙酸为底物，产生的当归酰辅酶A滴度达到6.4 mg·L-1;以当归酸为底物产生的当归酰辅酶A滴度达到40 mg·L-1。酿酒酵母的转化方法有化学法和电击法，其中电击法常用的是指数衰减脉冲波，而利用方波脉冲对酵母转化质粒等大分子的研究较少。冀照君等[7]在0.6 mol·L-1的蔗糖溶液中优化了方波脉冲电穿孔酵母细胞的条件，表明方波脉冲可以有效增强酵母细胞通透性，但没有开展酵母转化试验。本试验在1M山梨醇的电击缓冲体系中，以酿酒酵母EGY48营养缺陷型菌株为研究对象，优化方波脉冲电击参数，建立了稳定的方波脉冲电转化方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 酵母菌株和质粒

从OriGene公司购买DupLEX-ATM酵母双杂交试剂盒。使用的酵母为营养缺陷型菌株EGY48（MATα，trp1，his3，ura3，leu2：：6，LexAop-LEU2），该菌株已导入pSH18-34报告质粒和pEG202-GID1质粒，这两个质粒分别包含URA3和HIS3基因。试验中，酵母转化用pJG4-5-D8N质粒包含TRP1基因。

1.1.2 主要生化试剂

山梨醇、尿嘧啶、组氨酸、色氨酸、YNB均购于上海生工生物有限公司。

1.1.3 主要仪器和耗材

ECM830型方形波电转仪和1 mm电转化杯为美国BTX公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 酵母感受态细胞制备

每组处理使用同一批酵母感受态细胞进行试验，参照OriGene公司试剂盒操作指南和BTX公司ECM 399型电转化仪实验指南制备感受态细胞。用接种环取EGY48菌株在YNB（-His-Ura）平板上划线培养;30 ℃下培养3 d后，挑取单菌落，接种于10 mL YNB（-His-Ura）液体培养基，30℃、200 rpm培养16～

20 h;取100 μL培养液稀释10倍，测量OD600吸光值为0.5～0.8;吸取1.25～2.00 mL菌液到100 mL YNB（-His-Ura）液体培养基，30℃、200 rpm培养5～6 h，OD600吸光值为0.6～0.8;5 000 rpm离心5 min，去掉上清，收集菌体，加入30 mL冰预冷的无菌水，重悬菌体;用无菌水重复清洗两次;离心收集菌体，倒掉上清，加入20 mL预冷的1M山梨醇重悬;离心后，去掉上清，加入1.2 mL预冷的1M山梨醇重悬;按每管70μL分装，备用。

1.2.2 酵母转化

用试剂盒提取pJG4-5-D8N质粒，测定浓度为

350 ng/μL;取1 μL加入酵母感受态细胞，轻轻混匀;冰上静置5 min，轻轻吸出加入预冷的电击转化杯;按照文中表述的不同参数电击转化;迅速向电击杯加入1 mL预冷的1M山梨醇;吸出菌液，转移到1.5 mL离心管，离心收集菌体;用残留的少量上清液重悬菌体后，菌液转移到YNB（-His-Ura-Trp）平板上推平板，30 ℃倒置培养3～5 d。

1.2.3 酵母转化率

每个电击转化事件中，pJG4-5-D8N质粒用量约为350 ng。酵母转化率换算为每微克质粒转化子数，应乘以2.86系数。

1.2.4 酵母转化子验证

制备少量酵母菌液作为模板，用引物对D8N-1（5′-AAGCGCGAGTACCAAGACGCC-3′）和D8N-2（5′-CACGGCGGGCGGGAGATCG-3′）进行扩增验证。扩增条件为：98 ℃预变性5 min，1个循环;94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环;72 ℃延伸5 min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳约20 min，凝胶成像系统观察照相。

2 结果与分析

2.1 方波脉冲电压优化

ECM830型方形波电转化仪有低压和高压两种电击模式，低压模式电压范围是5～500 V，脉冲宽度为10 μs～10 s;高压模式电压范围是505～3 000 V，脉冲宽度10～500 μs。由于低压和高压模式的脉冲宽度范围限制，分别选择低压模式脉冲电压500 V和高压模式脉冲电压750 V，进行酵母电转化试验。电击转化结果表明，设置脉冲电压500 V，脉冲宽度4 ms，单次脉冲仅能获得1～2个转化子;脉冲2次，能获得约10个转化子。而在高压模式下，脉冲电压750 V，脉冲宽度400 μs，分别脉冲5、8和10次，仅能获得少量转化子（见表1）。这说明采用低压模式，设置方波脉冲电压500 V较适合酵母转化。

2.2 方波脉冲次数优化

在低压模式下，设置脉冲电压500 V，脉冲宽度4 ms，脉冲次数分别设为2、3、4、5、6次，对酵母进行电转化。结果表明，脉冲2次获得酵母转化子数量较少;脉冲5次、6次，酵母转化子数量在10～20;脉冲4次酵母转化子达到30个;脉冲3次获得的酵母转化子最多，达到77个（见表2）。这说明在脉冲电压500 V、脉冲宽度4 ms的条件下，脉冲3次的酵母转化效率较高。

2.3 脉冲宽度优化

在低压模式下，设置脉冲电压500 V，脉冲宽度分别为5 ms、10 ms、15 ms、20 ms、25 ms。通过单次脉冲转化酵母，比较不同脉冲宽度的电转化效果。结果表明（见表3），脉冲宽度为5 ms、10 ms时，获得酵母转化子数量分布在25～46;脉冲宽度为15 ms时，获得酵母转化子急剧增加到167个;脉冲宽度增加为20 ms、25 ms时，酵母转化子数量反而降低，而且分别有约20.1%和31.7%的菌落在培养3 d后才出现，生长速度减缓。这说明用脉冲电压500 V进行单次电击，脉冲宽度在15 ms时，酵母转化效率较高。

2.4 不同脉冲宽度3次脉冲的转化效果比较

在低压模式下，设置脉冲电压500 V，脉冲次数为3次，脉冲宽度分别为5 ms、10 ms、15 ms、20 ms、25 ms。酵母转化结果表明，脉冲宽度为10 ms、15 ms、20 ms时，酵母转化子数量均分布在50～70范围内;脉冲宽度为25 ms时，获得的酵母转化子分布在60～90范围内（表4）。然而，观察菌落生长情况，发现10 ms和15 ms脉冲处理酵母转化子生长速度较快，菌落大小均匀一致;而20 ms和25 ms处理中，分别约有49.5%和72.3%菌落在培养3 d后才出现，生长速度减缓。

2.5 酵母转化子鉴定

每个平板随机挑取酵母单菌落，在10 μL的ddH2O中吹吸混匀，取1 μL混悬菌液为模板，扩增D8基因片段。电泳结果显示，在所有检测的酵母单菌落中均扩增出约500 bp的目标片段，而未转化质粒的酵母阴性对照中不能扩增出目标带（见图1）。这表明在YNB（-His-Ura-Trp）平板中生长的酵母单菌落为阳性转化子。

3 小结

ECM830型方形波电转化仪在不同脉冲电压模式下，脉冲宽度范围不同，在高压模式下，脉冲宽度上限仅为500 μs。而采用指数衰减波电转化酵母时，常用脉冲宽度为4～4.5 ms。推测在高压模式下，脉冲宽度可能难以满足酵母电转化条件。试验中，设置脉冲电压750 V，脉冲宽度400 μs，脉冲10次，仅获得极少的酵母转化子，表明在高压模式下电转化酵母难度较大。因此，选择在脉冲电压500 V的低压模式下，优化方波脉冲电转化条件。

脉冲次数是电转化的一个重要参数，脉冲次数太少对细胞的穿孔效果不好，影响质粒进入细胞;脉冲次数过多，对细胞造成的损伤大，细胞难以存活，导致转化效率降低。试验中，脉冲电压500 V，脉冲宽度4 ms，脉冲3次时转化效率最高，达到77个，进一步增加脉冲次数，转化子数量反而逐渐减少。表明脉冲宽度在4 ms 及更长时，脉冲次数应该在3次以内。

在酵母电转化过程中，脉冲电压为500 V时，获得大量的酵母转化子，表明在细胞两侧施加的电压能够产生微孔，并且微孔大小可以使质粒进入细胞。脉冲宽度也是电转化的重要参数，对细胞膜微孔的形成、形态维持、孔径大小有重要影响。在脉冲电压为500 V时，分析了不同脉冲宽度对酵母转化的影响，试验显示，脉冲宽度为15 ms时，获得的酵母转化子最多，达到167个，远远高于其他脉冲宽度处理获得的酵母转化子数量。这说明脉冲电压为500 V，脉冲宽度为15 ms，单次脉冲在细胞膜表面产生的微孔数量和大小最有利于质粒转移。

进一步探讨不同脉冲宽度多次脉冲电转化酵母的效果，结果显示脉冲宽度为10 ms、15 ms、20 ms和25 ms时，酵母转化子数量分布在50～90，没有明显差异。然而，脉冲宽度为20 ms和25 ms时，可能对细胞伤害较大，分别约有49.5%和72.3%的菌落生长速度减缓。综合试验结果，方波脉冲电转化酵母，脉冲电压为500 V，脉冲宽度为15 ms，脉冲次数为1～3次时，质粒转化效率较高。

参考文献：

[1] M. Takahashi， T. Furukawa， H. Saitoh， et al. Gene transfer into human leukemia cell lines by electroporation： experience with exponentially decaying and square wave pulse[J]. Leukemia Research，1991，15（6）：507-513.

[2] Y. Liu， R. Bergan. Improved intracellular delivery of oligonucleotides by square wave electroporation[J]. Antisense and Nucleic Acid Drug Development，2001，11（1）：7-14.

[3] D.A. Vierra， S.Q. Irvine. Optimized conditions for transgenesis of the ascidian Ciona using square wave electroporation[J]. Development Genes and Evolution，2012，222（1）：55-61.

[4] J.M. Correnti， E.J. Pearce. Transgene expression in Schistosoma mansoni： introduction of RNA into schistosomula by electroporation[J]. Molecular and Biochemical Parasitology，2004，137（1）：75-79.

[5] J.W. Ross， J.J. Whyte， J. Zhao， et al. Optimization of square-wave electroporation for transfection of porcine fetal fibroblasts[J]. Transgenic Research，2010，19（4）：611-620.

[6] R. Callari， D. Fischer， H. Heider， et al. Biosynthesis of angelyl-CoA in Saccharomyces cerevisiae[J]. Microbial Cell Factories，2018，17（1）：72.

[7] 冀照君，孫波，迟玉杰，等.方波脉冲电穿孔法提高酵母菌细胞通透性的条件优化[J].食品科学，2010，31（15）：50-54.