枸杞总黄酮回流—超声复合提取工艺优化研究

康磊　于惠

摘要[目的]优化提取枸杞总黄酮的最佳工艺条件。 [方法]以宁夏枸杞作为研究对象，采用回流-超声复合式提取方法，分别通过单因素试验及正交试验设计，对枸杞中的有效成分总黄酮的提取和测定工艺条件进行优化。 [结果]得到枸杞中总黄酮测定的最优条件为 利用石油醚对枸杞先进行回流提取，然后使用60%的乙醇溶液，料液比为1∶40 （g∶mL），在70 ℃条件下提取30 min，取次数为2次。利用优化参数对枸杞中总黄酮的含量测定，经计算，该方法的相对标准偏差（RSD）为0.91%，加标回收率值在98%以上。 [结论]该方法具有准确率高、成本低、设备简单、操作便捷、易于推广的特点。

关键词枸杞；总黄酮；提取工艺；回流-超声复合式提取法

中图分类号TS201.1文献标识码A文章编号0517-6611（2018）28-0158-04

Study on the Optimized Conditions by Refluxultrasonic Extraction Flavones from Lycium barbarum

KANG Lei1， 2，3，YU Hui1， 2，3

（1.Ningxia Testing Laboratory of Coal Chemical， Yinchuan， Ningxia 750002；2.State Key Testing Laboratory of Coal Chemical， Yinchuan， Ningxia 750002；3.Chemical Laboratory Center of Ningxia Baota， Yinchuan， Ningxia 750002）

Abstract[Objective]To optimize the extraction technology of total flavonoids from Lycium barbarum L. [Method]Taking Ningxia Lycium barbarum L. as the research object， the method of reflux ultrasonic combined extraction was adopted.The extraction and determination of total flavonoids in Lycium barbarum L. were optimized by single factor test and orthogonal design.[Result]The optimum conditions for the determination of total flavonoids in Lycium barbarum were as follows： petroleum ether was used to extract the total flavonoids from Lycium barbarum by reflux， then 60% ethanol solution was used， the ratio of material to liquid was 1∶40 （g∶mL）， and the extraction time was 2 times at 70 ℃ for 30 minutes.The content of total flavonoids in Lycium barbarum was determined by the optimized parameters. The relative standard deviation （RSD） of the method was 0.91%， and the recovery was over 98%.[Conclusion] The method has the characteristics of high accuracy， low cost， simple equipment， convenient operation and easy popularization.

Key wordsLycium barbarum；Total flavonoids；Extraction process；Refluxultrasonic compound extraction method

枸杞（Lycium chinense）別名苟起子、甜菜子、血枸子，属于茄科枸杞属植物，国内主要产于宁夏、新疆、甘肃等地区，其中属宁夏地区产出的枸杞最为有名[1]。枸杞具有较高的药用价值，具有解热及治疗糖尿病、高血压、肝肾疾病等功效[2-5]。通过对枸杞有效成分研究发现，枸杞中含有较高的黄酮及芦丁，其中黄酮类化合物具有多种生物活性，具有抗氧化性和降血脂作用，对预防动脉粥样硬化有较好的疗效[6]。因此，如何高效提取枸杞叶中总黄酮并进行测量成为人们关注的焦点。笔者采用回流-超声辅助复合提取法对枸杞中的有效成分总黄酮进行了提取，通过对提取条件进行单因素试验和正交试验，进一步优化提取枸杞总黄酮的最佳工艺条件，并采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH分光光度比色法，对枸杞中总黄酮的含量进行测试。通过对该方法的精密度和加标回收率进行考察，证明该方法具有操作简单、重现性好、专属性较强及稳定性好等优点，易于推广。

1材料与方法

1.1材料

无水乙醇，分析纯（AR），天津市富宇精细化工有限公司；乙醇（95%），分析纯（AR），天津市富宇精细化工有限公司；石油醚（60～90 ℃），分析纯（AR），天津市富宇精细化工有限公司；亚硝酸钠，分析纯（AR），四川西陇化工有限公司；氢氧化钠，分析纯（AR），西安化学试剂厂；硝酸铝，分析纯（AR），天津市凯通化学试剂有限公司；芦丁（HPLC≥95%），北京北纳创联生物技术研究院。枸杞子，市售，产自宁夏中宁县，经鉴定为枸杞的干燥成熟果实。

紫外可见分光光度计（Evolution300），美国；1/10万电子天平（CP225D），德国sartorius有限责任公司；超声波清洗器（KQ-5200DE），昆山舒美超声仪器有限公司；仪表恒温水浴锅，上海树立仪器仪表有限公司；高速多功能粉碎机（RH-100），浙江荣浩工贸有限公司。

1.2测定分析方法

准确移取一定量样品溶液（视样品溶液含量而定）置于25.00 mL的具塞比色管中，加入0.8 mL的50 g/L NaNO2溶液，静置6 min后，加入0.8 mL的100 g/L Al（NO3）3 溶液，再次静置6 min；后加入40 g/L NaOH溶液10 mL，用乙醇溶液定容至刻度，摇匀，待显色稳定后，用10 mm比色皿，以试剂空白作为参比溶液，在波长510 nm下测定溶液的吸光度A，根据线性回归方程计算，求出吸取样品溶液中的黄酮类化合物的含量。

枸杞中总黄酮的含量按式（1）计算。

w=m2×100m1×V×1 000×1 000（1）

式（1）中，w为黄酮类化合物的总含量（g/kg）；m1为试料的质量（g）；

m2为由标准曲线计算得出的吸取待测试液黄酮类化合物含量（mg）；

V为试液的移取体积（mL）。

1.3标准曲线的确定

分别吸取0、0.25、0.50、1.00、2.50、3.50、5.00、7.50、10.00 mL 0.200 0 g/L芦丁标准使用液（相当于各溶液中分别含有0、0.05、0.10、0.20、0.50、0.70、1.00、1.50、2.00 mg芦丁）置于25.00 mL具塞比色管中，按照“1.2”所述方法测定吸光度值，以吸光度（A）作为纵坐标，芦丁的质量（m）为横坐标，绘制芦丁质量（m）-吸光度（A）标准曲线，结果见图1。芦丁溶液的线性回归方程为A=0.485m-0.002 4，R2=0.999 9。其中，A表示溶液的吸光度，m表示芦丁质量（mg）。

1.4样品及溶液的制备

将购得的枸杞首先在40 ℃下低温烘干24 h以除去部分水分，随后将枸杞放入冰箱冷冻室，在-15～ -10 ℃条件下对枸杞进行冷冻干燥24 h，以防止枸杞在粉碎过程中发生黏连现象。冷冻枸杞样品取出后应立即用粉碎机粉碎，并迅速过0.5 mm 标准筛。将制备好的枸杞粉末置于密封干燥处低温保存。

精确称取枸杞样品粉末1.0 g（精确至0.000 2 g），置于自制尼龙袋中，封好袋口，放于索氏提取器中，用石油醚进行回流以除去脂类等杂质。待残渣中的石油醚挥发后，将包有样品的尼龙袋置于100 mL锥形瓶中，加入乙醇溶液，在一定温度和超声频率下进行超声提取。多次提取后，合并提取液，并将提取液移至100 mL的容量瓶中，将锥形瓶和尼龙袋用60%乙醇溶液多次洗涤，并将洗涤液一并移入100 mL的容量瓶中，用60%乙醇溶液进行定容，所得溶液待测。

1.5提取工艺条件的优化

该试验首先考察了乙醇体积分数（Vm）、超声提取温度（T）、超声提取时间（t）、料液比（枸杞质量与乙醇体积的比值）及提取次数（n）在单因素条件下对总黄酮提取工艺的影响。同时，为避免各影响要素间相互交叉影响，在单因素试验的基础上，进一步以乙醇体积分数、料液比、超声提取温度、超声提取时间4个因素进行L9（34）正交试验设计。正交试验因素水平设计见表1。

2结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1乙醇體积分数对总黄酮提取量的影响。

由图2可以看出，增大乙醇体积分数有利于溶剂中的总黄酮更加充分地溶解。然而，当溶剂中乙醇体积分数大于60%时，黄酮提取量呈逐渐下降趋势，这可能是由于过高的提取液体积分数容易导致枸杞中更多的杂质溶出造成的。因此，该研究选用体积分数为60%的乙醇进行后续研究。

2.1.2料液比对总黄酮提取量的影响。

由图3可以看出，当料液比为1∶40（g∶mL）时，枸杞中黄酮提取量到达最大值。在超声提取过程中，枸杞与溶剂之间产生超声空化效应[7]，对总黄酮分子的运动起加速作用，使枸杞中的总黄酮较容易溶解到溶剂中。随着溶剂的增加，有助于总黄酮的提取。但当料液比中溶剂过大时，过多的杂质溶出，不利于总黄酮的提取。因此，选择使用1∶40（g∶mL）的料液比较为合适。

2.1.3超声提取温度对总黄酮提取量的影响。

如图4所示，随着提取温度的上升，枸杞中黄酮提取量呈先增大后缓慢减小的趋势，当提取温度为 60 ℃时黄酮提取量到达最大值。在超声作用下，随着温度的升高，更多的枸杞总黄酮分子被溶解释放出来，黄酮提取量逐渐升高。然而，当提取温度过高时，一方面高温容易使枸杞中更多的杂质被溶解出来，使得枸杞中黄酮提取量相对降低；另一方面，过高的温度可能会致使总黄酮的氧化，从而降低黄酮的提取量。

2.1.4超声提取时间对总黄酮提取量的影响。

图5为超声时间对枸杞中黄酮提取量的影响。如图5所示，当超声时间相对较短时，枸杞中的总黄酮无法充分提取出来，因此黄酮提取量相对较低。随着超声时间的延长，黄酮提取量显著增大。当超声时间超过30 min之后，随着超声时间的增长，由于枸杞中杂质析出的干扰，黄酮提取量有所下降。

2.1.5超声提取次数对总黄酮提取量的影响。

从图6可以看出，提取1次的提取量最大，提取1次的提取量约是第2次提取的10倍左右，而第3～5次的提取量很低。超声对化学反应的促进作用可以归结为超声加热作用、机械传质作用及超声空化这3个方面[8]。3个方面的作用不仅可以提高反应体系中黄酮分子向外扩散的速度，还可降低反应体系中黄酮分子扩散层的厚度，有利于总黄酮的析出与提取；同时，超声空化作用可进一步疏通枸杞内部的扩散通道，利用超声空化作用产生的大量微小气泡，将总黄酮从枸杞内部提取出来，进而提高提取效率。因此反应采用超声提取工艺后，提取次数可明显减少。因此，从缩短试验周期、节约能源方面综合考虑，选择提取2次。

2.2正交试验确定枸杞总黄酮提取的最佳提取条件全面考虑提取工艺条件对提取结果的影响，根据上述单因素试验的结果，设计L9（34）正交试验，试验结果见表2。

根据正交试验结果进行分析，各个要素对枸杞中总黄酮提取率影响的大小情况依次为乙醇体积分数>超声温度>超声提取时间>料液比。同时，由正交优化确定的最佳提取条件为乙醇体积分数60%，料液比1∶40（g∶mL），超声温度70 ℃，超声提取时间30 min，超声提取次数2次。

2.3精密度试验及加标回收率试验

2.3.1精密度试验。

分别准确称取枸杞粉末1.00 g（平行3份），按照样品溶液制备办法处理，采取“1.2”的办法显色之后，在波长510 nm下，测定溶液的A。精密度结果见表3。从表3可知，RSD值为0.91%，说明此方法的精密度数据良好。

2.3.2加标回收率试验。

表4为加标回收率试验结果，从表4中可知，通过在超声阶段加入不同量的芦丁标准品，得到该方法的加标回收率值均在98%以上，进一步证明该提取和检测方法的可靠性。

3结论

试验通过采用回流-超声复合式提取法来提取枸杞中的总黄酮，依次对提取液体积（Vm）、料液比、提取时间（t）、提取温度（T）及提取次数（n）进行单因素试验。之后以Vm、料液

比、T、t为因素的正交试验，选择出超声辅助提取枸杞总黄酮的最佳工艺条件为选择提取液体积为60%，料液比为1∶40（g∶mL），在70 ℃下提取30 min，反复提取2次。各个因素对枸杞中的总黄酮提取效果影响的顺序依次是：Vm>T>t>料液比。利用上述優化参数对枸杞中总黄酮含量进行测定，经计算，该方法的相对标准偏差（RSD）为0.91%，加标回收率值在98%以上。该工艺条件很简单，操作步骤比较容易，稳定性高，能够有效克服常规办法提取温度高、提取时间长等操作步骤繁琐的缺点。

参考文献

[1] 白寿宁.宁夏枸杞研究[M].银川：宁夏人民出版社，1998：552-559.

[2] 张玉玺，马红军，何薇.宁夏枸杞菜中总黄酮和芦丁含量的动态变化研究[J].当代化工，2014，43（12）：2509-2510.

[3] 贺晓慧，贾孟辉，俞维，等.宁夏枸杞叶基础研究述要及应用开发的前景[J].时珍国医国药，2007，18（5）：1111-1112.

[4] 牛东玲，马婷婷，张自萍.宁夏枸杞叶中总黄酮含量与抗氧化活性关系[J].宁夏大学学报（自然科学版），2012，33（1）：55-57.

[5] 唐华丽，孙桂菊，陈忱.枸杞多糖的化学分析与降血糖作用研究进展[J].食品与机械，2013，29（6）：244-247，252.

[6] MA M， LIU G H， YU Z H，et al.Effect of the Lycium barbaarum ploysaccharides administration on blood lipid metabolism and oxidative stress of mice fed high-fat diet in vivo[J].Food chenistry，2009，113：872-877.

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[8] CHEN Z B，KANG L，DI D L，et al.Chloromethylation research of LX-1180 macroporous adsorption resin in ultrasonic environment[J].Advanced materials research，2011，233/234/235：2893-2897.