芦苇根系及根际土中酚酸类化感物质的水分响应特性研究

孙盈　李萍萍　付为国

摘要[目的]研究蘆苇根系及根际土中酚酸类化感物质的水分响应特性。[方法]分析芦苇中主要酚酸类化感物质的水环境响应特性，采用高效液相色谱法对不同水分环境下芦苇根系及根际土中酚酸类物质进行分离和鉴定。[结果]从芦苇根系及根际土中均分离出没食子酸、香豆酸、香草酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、水杨酸和苯甲酸这8种酚酸类物质，且二者中分离出的8种酚酸类物质含量与芦苇根际土相对含水量均呈显著负相关，即随着根际土相对含水量的上升，酚酸类物质的含量均呈现下降趋势，且各种酚酸类物质对水分的响应趋势均可用线性方程较好拟合。在芦苇根系中，香豆酸、阿魏酸和没食子酸这3种酚酸类物质水分响应较为明显，在芦苇根际土中，香豆酸和阿魏酸对芦苇腐解土的水分响应较为明显。[结论]香豆酸和阿魏酸是控制芦苇种群和虉草种群竞争平衡状态较为关键的2种酚酸类化感物质。

关键词芦苇；酚酸；根系；根际土；化感作用；水分响应

中图分类号S181文献标识码A文章编号0517-6611（2018）25-0071-04

Study on the Moisture Response of Phenolic Acids in Phragmites australis Root and Rhizosperic Soil

SUN Ying1，LI Pingping2，FU Weiguo1，2

（1.Agricultural Engineering Research Institute， Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu 212013；2.Cooperative Innovation Center of Southern Modern Forestry，Nanjing Forestry University，Nanjing，Jiangsu 210037）

Abstract[Objective]To study the moisture response of phenolic acids in Phragmites australis root and rhizosperic soil. [Method] The responses to moisture of the main phenolic allelochemicals in the P. australix communis were analyzed， and high performance liquid chromatography （HPLC） was used to separate and identify phenolic acids substances in P. australix root and rhizosperic soil with different moisture content conditions. [Result] 8 kinds of phenolic acids were separated and identified from both P. australix root and rhizosperic soil which are gallic acid， coumaric acid， vanillic acid， syringic acid， pcoumaric acid， ferulic acid， salicylic acid， and benzoic acid . There was a significant linear negative correlation between every identified phenolic acid and the relative moisture content of P. australis rhizosperic soil， which is， as an increase in the relative moisture content of P. australis decomposed soil， content of every identified phenolic acid showed a downward trend， and the response curve of content of every identified phenolic acid to the relative moisture content of P. australix root and rhizosperic soil can be fitted well with a linear equation. Responses of coumarinic acid， gallic acid and ferulic acid to rhizosperic soil moisture were most obvious among P. australix root， and responses of coumarinic acid and ferulic acid to rhizosperic soil moisture were most obvious among P. australix rhizosperic soil. [Conclusion]The results indicated that coumaric acid and ferulic acid were the key to control the balance of P. australis population and P. arundinacea population.

Key wordsPhragmites australis；Phenolic acids；Root；Rhizosperic soil；Allelopathy；Response to moisture

化感作用在植物中广泛存在，各种植物通过向外界环境释放化感物质从而直接或间接地对同种或异种植物产生有害或有益的作用[1]。植物根分泌的化学物质是化感物质的重要组成之一，根分泌物是指那些健康完整的活体植物的根系组织向土壤中释放的化学物质，主要分为三大类：第一类为大分子有机物，包括糖、蛋白质、酶和凝胶等；第二类为小分子酸、酚和酮等；第三类为生长激素、黄酮和甾类等[2]。Birkett等[3]研究得出根际土壤（rhizosperic soil）是根分泌物及其转化分解产物的储存库，通过根分泌释放的化感物质直接进入土壤中。有些植物释放植物毒素并对其他植物种产生影响，其化学物质须通过土壤媒介移动到目标植物的根部，由根分泌到土壤中的这些化感物质经历了不同类型的迁移和生物降解[4]。在对植物根系分泌物的化感作用进行探索时，应从根系及根际土壤2个部分着手。

芦苇（Phragmites australis）是湿地常见的根茎类禾本科植物，无性繁殖能力强，常在栖息地形成单优群落[5]。相关研究证实芦苇是一种强化感植物，对羊角月牙藻、雷氏衣藻和水华微囊藻等藻类以及一枝黄花（ Solidago canadensis Linn）、互花米草（ Spartina alterniflora Lois）、蒲公英（Taraxacum mongolicum）、小飞蓬（Conyza canadensis L.）和田菁（Sesbania cannabina）等高等植物均有不同程度的化感作用[6-10]。

前期研究发现，在长江下游的镇江滨江湿地，从远离岸边的浅滩到近岸，随着基底抬升和基底土壤含水量下降，存在由裸滩→虉草（Phalaris arundinacea）群落→虉草-芦苇群落→芦苇群落的植被演替群落过程[11]，即存在随着滨江湿地基底抬升，芦苇种群逐渐完全替代虉草种群的现象。芦苇和虉草同为有较强去污能力的湿地植物，且二者具有周年互补性，因此2个物种被广泛用来构建人工湿地植物群落[12]。但当芦苇-虉草人工湿地运行若干年后，芦苇种群通常可完全替代虉草种群，导致人工湿地的去污功能受到削弱[13]，而事实上，这类人工湿地在运行过程中，常因一些固体颗粒物的长期淤积导致基底逐渐抬升以及土壤含水量下降。因此，在自然湿地和人工湿地中，均出现随着基底土壤含水量下降，湿地芦苇种群逐渐替代虉草种群的现象。鉴于芦苇是一种强化感植物以及化感作用具有强烈的“随着土壤水分降低，化感抑制效应增加”的水环境响应特性[14]，有理由推断：芦苇种群对虉草种群的逐步替代过程正是芦苇对虉草化感抑制效应随土壤含水量降低而逐渐增强的过程。

化感物质的释放途径包括雨雾淋溶、植物挥发、植株残体降解和根系分泌等[15]，与土壤水分含量相關性较高的释放途径只有进入土壤中的植株残体降解和根系分泌2种。尹淇淋[12]研究了滨江湿地的野生芦苇根系分泌物对虉草的化感抑制效应及其水环境响应特性，并用高效液相色谱法（HPLC）分离和鉴定出根系及根际土壤中所含的香豆酸、香草酸、没食子酸、苯甲酸、丁香酸、阿魏酸和水杨酸7种酚酸物质，但滨江湿地环境较为复杂，土壤中植物残留繁多，试验结果受不确定因素影响较大，且其选取的酚酸对照品范围较小。笔者在其研究的基础上，排除其他植物残体的干扰，从滨江湿地取芦苇根进行桶栽培养，选取常见的10种具有化感效应的酚酸物质，利用高效液相色谱法对芦苇根及根际土壤中各酚酸类物质进行分离、鉴定和测定，不仅可进一步研究芦苇对虉草化感效应的水环境响应特性，而且也可探索出维持虉草芦苇稳定共存的湿地基底土壤含水量范围，进而为虉草芦苇人工湿地的群落稳定管理提供理论支持和技术指导。

1材料与方法

1.1材料

芦苇根：2015年10月，于镇江滨江湿地挖取大小相近芦苇根。试验用土：自滨江湿地光滩采取一定量新淤积的泥土，晒干、磨碎、去杂、过筛。

1.2方法

1.2.1芦苇栽培试验。

将泥土等体积置于12个塑料桶（上径62 cm、下径48 cm、高52 cm）。将等数量芦苇根栽于12个塑料桶中，期间设置T1、T2、T3和T4共4个水分处理，利用称重法将4个处理的相对含水量分别维持在65%～70%、75%～80%、85%～90%和95%～100%，每个处理3次重复。 2017年7月15 日，对各处理芦苇根和根际土壤中酚酸类物质进行分离、鉴定和测定，后取其均值分析。

1.2.2芦苇根及根际土壤中酚酸类物质的 HPLC分析。

1.2.2.1仪器与试剂。

Thermo UltiMate 3000 型高效液相色谱仪（ Thermo Fisher公司）；SHZ-D（Ⅲ）真空泵（河南予华仪器有限公司）；Neofugo 18R高速离心机（力康生物医疗科技）；CHA-S气浴恒温振荡器（金坛荣华仪器制造有限公司）；BSA224S电子分析天平（万分之一，德国Sartorius）。

标准品没食子酸、阿魏酸、苯甲酸、香草酸、香豆酸、丁香酸、对香豆酸、对羟基苯甲酸、水杨酸、咖啡酸，均购自上海晨易生物公司；甲醇为色谱级，水为超纯水。

1.2.2.2色谱条件。

色谱柱为Thermo C18（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流动相A为甲醇；流动相B为1%乙酸水溶液；UV检测波长为280 nm；柱温为30 ℃；梯度洗脱程序：0～8 min，40%A；>8～19 min，35%A；>19～30 min，10%A；流速为1.0 mL/min。

1.2.2.3标准溶液配制。

精密称取上述10种酚酸标准品各1 mg，置于10 mL 容量瓶中，加50%甲醇水溶液溶解并定容，得1 mg/mL的酚酸标准混合液，依次用50%甲醇水溶液稀释2、10、50、100倍配制成系列标准样品混合溶液。同时准确称取 10种酚酸标准品各10 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇水溶液溶解并定容，得1 mg/mL的单一种酚酸溶液，用于判定每种酚酸标准品的出峰时间，即在混合标准品中的出峰位置。

1.2.2.4芦苇根与根际土样品溶液的制备。

每份芦苇根和根际土壤样品均取10 g，置于锥形瓶中，加入50%甲醇水溶液100 mL，常温下振荡提取6 h，后上离心机分离取上清液，再用旋转蒸发仪（真空，30 ℃）浓缩至1 mL，过0.22 μm有机过滤膜，制成供试样品溶液。

1.3统计分析

对芦苇根及根际土壤中酚酸物质含量与土壤相对含水量的响应关系进行线性回归分析。运用Excel 2007及SPSS11.5统计软件进行数据处理和显著性分析。

2结果与分析

2.1标准品和供试样品色谱图

对10种酚酸类物质标准样品进行最大吸收光谱扫描，扫描波长为190～400 nm。分析不同酚酸类物质的最大吸收光谱，10种酚酸类物质在280 nm 左右均有较大吸收峰，因此，选取280 nm作为酚酸类物质的定量检测波长。由于酚酸类物质中的酚羟基与羧基在水溶液中易发生电离，极性增强，在固定相上会形成双重保留，使色谱峰拖尾严重，加入适量酸性调节剂，可使多酚的电离受到一定抑制，极性减弱，增强其在固定相上的保留，使分离效果和峰型得到改善[16]。采用乙酸作为流动相的酸性调节剂，其浓度对酚酸类物质的出峰时间和峰型有一定的影响。分别考察了0.5%～2.0%浓度乙酸水溶液对10种酚酸类物质的分离效果，最终选择1.0%乙酸水溶液。采用等度洗脱时，各峰分离不理想，采用梯度洗脱后分离较好，经多次梯度洗脱条件优化，最理想洗脱条件为0～8 min，40%甲醇；>8～19 min，35%甲醇；>19～30 min，10%甲醇。按照方法提供的液相色谱分离和分析条件，分别吸取标准品溶液和芦苇根系、根际土壤供试样品溶液各10 μL，自动进样器进样，分析结果如图1所示。在上述色谱条件下，均能得到较好的分离、峰型良好、保留时间稳定，芦苇根系和芦苇根际土中均含有没食子酸、香豆酸、香草酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、水杨酸和苯甲酸这8种酚酸类物质。

2.2芦苇根系及芦苇根际土中酚酸类物质水分响应关系

将已逐级稀释配制的10种酚酸混合液分别进样10 μL，以各种酚酸浓度x（μg/mL）为横坐标，其峰面积值S（mAU）为纵坐标绘制标准曲线，计算得到10种酚酸物质的线性回归方程、判定系数及线性范围，以仪器信噪比（S/N≥3）确定 10 种酚酸物质的最低检出限（表1）。10种酚酸物质的线性回归方程判定系数均达0.999 0以上，在0.01水平极显著相关，因此适用于对芦苇腐解土中酚酸类物质的HPLC定量计算分析。

根据以上各标准曲线的线性回归方程，计算出不同处理下芦苇根部及根际土壤样品中各酚酸物质的含量。进而将各酚酸类物质含量与其对应芦苇根际土壤的相对含水量进行线性回归拟合，得出芦苇根部各酚酸物质拟合方程：香豆酸（y=-0.311 1x+54.416 0，R2=0.967 6）、阿魏酸（y=-0.443 1x+50.877 0，R2=0.959 8）、没食子酸（y=-0.202 6x+24.085 0，R2=0.945 8）、苯甲酸（y=-0.123 4x+15.764 0，R2=0.959 8）、对香豆酸（y=-0.044 7x+7.618 2，R2=0.981 9）、丁香酸（y=-0.022 6x+3.571 2，R2=0.948 9）、香草酸（y=-0.031 3x+4792 5，R2=0.979 8）、水杨酸（y=-0.098 0x+11.837 0，R2=0982 2）；芦苇根际土壤各酚酸物质拟合方程：香豆酸（y=-0.168 0x+23.961 0，R2=0.941 3）、阿魏酸（y=-0.443 1x+50.877 0，R2=0.959 8）、没食子酸（y=-0.202 6x+24.085 0，R2=0.945 8）、苯甲酸（y=-0.123 4x+15.764 0，R2=0.959 8）、对香豆酸（y=-0.044 7x+7.618 2，R2=0.981 9）、丁香酸（y=-0.022 6x+3.571 2，R2=0.948 9）、香草酸（y=-0.031 3x+4792 5，R2=0.979 8）、水杨酸（y=-0.098 0x+11.837 0，R2=0.982 2），芦苇根部及根际土壤中各酚酸物质拟合见图2。

3结论与讨论

研究表明，芦苇根系及根际土中存在没食子酸、香豆酸、香草酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、水杨酸和苯甲酸这8种酚酸类物质，且在芦苇根系及根际土中这8种酚酸类物质含量与其土壤相对含水量均呈显著负相关，即随着土壤相对含水量的上升，芦苇根系及根际土中酚酸类物质均呈现下降趋势，不同酚酸类物质的含量与腐解土相对含水量的关系可用线性方程加以拟合。蘆苇根系及根际土中不同种类酚酸物质对腐解土中的水分响应强度存在较大差异，由各酚酸类物质对水分拟合方程的斜率判定，在芦苇根系中香豆酸、阿魏酸和没食子酸对土壤相对含水量的响应较为明显，在芦苇根际土中香豆酸和阿魏酸对土壤相对含水量的响应较为明显。由芦苇根系及根际土中各酚酸类物质含量的差异可知，在芦苇根系中香豆酸、阿魏酸、没食子酸在8种酚酸物质中含量较高，在芦苇根际土中香豆酸和阿魏酸含量明显高于其余6种酚酸物质。

综上分析，在对芦苇-虉草人工湿地进行管理时，为了保持芦苇种群与虉草种群长期竞争共存稳定，可通过调控湿地土壤中水分含量，重点调控芦苇根系和根际土中水分响应均较强且含量较高的香豆酸和阿魏酸的化感抑制强度，从而避免出现芦苇种群代替虉草种群的现象，防止虉草-人工湿地去污功能的丧失。

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