猪流行性腹泻病毒检测技术研究进展

芮聪杰　潘孝成　沈学怀

摘要猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的猪急性高度接触性肠道传染病，主要临床症状表现为呕吐、水样腹泻、脱水等。近年来，PED在全球范围内暴发流行，使养猪业遭受巨大的经济损失。对猪流行性腹泻的检测方法（病毒的分离和鉴定、免疫电镜法、免疫学检测法、分子生物学检测等）进行了综述，以期对猪流行性腹泻病毒的防控提供理论依据。

关键词猪流行性腹泻病毒；检测技术；研究进展

中图分类号S852.65+1文献标识码

A文章编号0517-6611（2018）25-0022-04

Research Progress on the Detection Technique of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

RUI Congjie1，2，PAN Xiaocheng1，SHEN Xuehuai1 et al

（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Anhui Academy of Agricultural Science，Hefei，Anhui 230031；2.College of Animal Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei，Anhui 230061）

AbstractPorcine epidemic diarrhea （PED），caused by porcine epidemic diarrhea virus （PEDV），is a highly contagious，acute enteric viral disease of swine characterized by vomiting，watery diarrhea，dehydration and death.In recent years，swine epidemic diarrhoea has become a global epidemic.As a result，the pig industry has suffered huge economic losses.This paper reviewed the methods to detect PEDV，such as isolation and identification of PEDV，immunoelectron microscopy methods，immunological methods and methods in molecular biology，so as to provide theoretical basis for prevention and control of porcine epidemic diarrhea virus .

Key wordsPorcine epidemic diarrhea virus；Detection technique；Research progress

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的猪急性高度接触性肠道传染病，主要表现为呕吐、水样腹泻、脱水等特征[1-2]。各年龄猪只均可发病，但以10日龄以内哺乳仔猪的病死率最高。该病最早于1971年在英格兰猪群中首次发现[3]。 1982年，比利时Pensaert等[4]分离出不同于传染性胃肠炎的病毒，将其命名为类冠状病毒CV777株； 随后英国、德国、捷克、匈牙利等国家相继报道有该病的发生。20世纪80年代，日本、韩国、泰国等亚洲国家也陆续有该病的报道。我国于1973年首次报道出现PEDV的感染，并于1982年分离该病毒获得成功[5]。自2010 年底以来，我国大部分地区暴发了由PEDV变异毒株引起的腹泻，此次疫情的临床症状较为严重，初生仔猪的病死率可达90%[6]，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。目前，该病在全球肆虐，美国、墨西哥、台湾、日本、加拿大、多米尼加共和国、哥伦比亚、秘鲁、韩国、乌克兰等国家和地区也相继暴发猪流行性腹泻疫情[7-8]，给各国养猪业带来严重损失，是近年来全球养猪业关注的疫病焦点。笔者对猪流行性腹泻病毒的检测方法（包括病毒的分离鉴定、免疫电镜法、免疫学检测、分子生物学检测等）进行了综述，以期对猪流行性腹泻病毒的防控提供理论依据。

1病毒分离与鉴定

PEDV屬于冠状病毒科冠状病毒属成员，核酸基因组为单股正链RNA囊膜病毒[7]。1982年，宣华等[5]以吉林分离毒株在胎猪肠组织原代单层细胞培养物中分离PEDV获得成功。1988年，瑞典学者Hofmann等[8]成功在Vero细胞中培养PEDV，并发现在培养基中加入胰酶有利于PEDV在Vero细胞的增殖。孙莹[9]从江苏省某大规模猪场感染PEDV的哺乳仔猪小肠内容物样品中分离到JSX2014毒株，接种Vero细胞产生的CPE病变明显，但此病变特征与PEDV经典株CV777在细胞上产生的大空泡、细胞融合及多核细胞等病变特征不一致。此毒株的第55代已达到TCID50为10-4.71/mL，与2010年底以来国内PEDV分离株的亲缘关系较近，与经典毒株CV777等的亲缘关系较远，为新型G2b型变异株。卓秀萍[10]利用Vero细胞分离出EM-P株，属于G1-1亚型，与CV777株、韩国、日本、泰国等其他国家的流行毒株及2010年前的中国毒株处于同一亚群，经测定病毒的TCID50为10-5.5/mL。利用Vero细胞培养并加入一定浓度的胰酶分离PEDV毒株已成为使用最多的方法，添加胰酶的浓度从2.5 μg/mL到60 μg/mL不等。潘溪[11]用未添加胰酶的维持液成功分离出一株SH6变异毒株，证实在培养PEDV的Vero细胞中可以不添加胰酶。Shirato等[12]研究表明，没有胰酶，PEDV可以在Vero细胞上增殖，但病毒释放入培养液被强烈抑制。培养PEDV的细胞除了最常用的Vero细胞外，还有PK、CPK、MA104、PK-15、ESX等[13]，其中常用的是PK-15细胞。

2免疫电镜法

免疫电子显微镜技术（immunoelectron microscopy，IEM）是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法。它主要分为两大类：一类是免疫凝集电镜技术，即采用抗原抗体凝集反应后，再经负染色直接在电镜下观察；另一类是免疫电镜定位技术。免疫电镜的应用使得抗原和抗体定位的研究进入到亚细胞的水平。由于PEDV属于冠状病毒，在形态和结构上与猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）在普通电镜下不容易区分。王继科等[14]建立了改进的直接IEM 方法，以鉴定、区分PEDV和TGEV，该方法具有3次筛选作用。2015年，Lavazza等[15]建立了检测PEDV等病毒的IAEM（immuno-aggregation electron microscopy）方法，该方法结合IEM法和ns-EM（negative staining electron microscopy method）法，是一种非常敏感和特异的方法。免疫电镜法虽然具有敏感性高、特异性强、定性准确等优点，但该方法对实验仪器的要求较高。

3免疫学检测方法

3.1血清中和试验（serum neutralization test，SNT）

血清中和试验通过检测免疫血清与病毒中和后病毒的感染力，来判定免疫血清对病毒的中和力，该方法的特异性和灵敏性均较高，主要用于病毒毒株的种型鉴定（该方法不仅可以定属，而且可以定型）、测定血清抗体效价、分析病毒的抗原性。谢明星等[16]于1988年采用固定病毒-稀释血清法，建立了检测血清中抗体消长规律的微量血清中和试验，结果表明该方法既可用于PED早期诊断，也可用于流行病学调查，此外还也能用于免疫水平的检测。石明明[17]在传统中和试验的基础上进行了改进，建立了快速、新型的PEDV中和抗体检测方法。试验使用的rPEDV-GFP病毒是通过反向遗传技术，将GFP荧光基因插入至PEDV基因序列中，由于GFP自带荧光，只要PEDV-GFP在细胞中复制，就能看见荧光，用TBS-380微型荧光计对其反应结果进行分析并建立线性关系，比较血清样品间抗体水平的高低，此方法与传统中和试验相比更省时间（12 h即可出结果）。

3.2免疫荧光法（immunofluorescence，IF）

免疫荧光法就是利用免疫荧光显微镜观察抗原与抗体特异性的结合，包括直接免疫荧光法、间接免疫荧光法。崔现兰等[18]建立了检测PEDV的直接免疫荧光法和间接免疫荧光法，其对猪流行性腹泻病毒（PEDV）人工感染仔猪的阳性检出率为91.3%（42/46）。林志雄等[19]用适应于Vero、Pk15等传代细胞株生长繁殖的PEDV-G1株建立直接免疫荧光法，同时与哈尔滨兽医研究所的荧光抗体方法比较，阳性符合率达95%（19/20），阴性符合率达90%（9/10），并不与猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、轮状病毒和大肠杆菌等发生交叉反应，表明该方法具有较高的准确性和特异性。朱维正等[20]用间接血凝法（IHA）和间接免疫荧光法（IFAT）对感染PEDV猪的血清进行检测，并对这2种方法进行比较，结果发现IHA的阳性检出率（50.43%）低于IFAT（89.25%）。免疫荧光法是比较经典的检测PEDV的方法。

3.3酶联免疫吸附实验（ELISA）

由于ELISA检测方法具有灵敏度高、特异性强、反应快速、操作相对简单、可对血清进行批量检测、既可以检测免疫后血清抗体也可以检测感染抗原等优点，该方法是检测PEDV应用最广泛的方法之一。潘溪[11]通過将PEDV的N基因克隆到pCoid-1DNA载体中进行原核表达，构建了pCoid-1-N的重组质粒，并将纯化的N蛋白进行包被，作为包被抗原构建间接ELISA方法，对50份已知来源和背景的血清进行了检测，符合率达94%。同时，还制备了N蛋白的单克隆抗体作为竞争性抗体，建立了竞争ELISA检测方法。郑芳园[21]将PEDV的S蛋白用pET-28a为载体进行原核表达，并将纯化的Sc蛋白作为包被抗原，建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法。将5份阳性血清进行1∶3 200倍稀释后检测结果呈阳性，证实了此方法的敏感性和重复性；利用该方法对伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型病毒（PCV2）、口蹄疫病毒（FMDV）、猪蓝耳病毒（PRRSV）的阳性血清进行检测，结果均呈阴性，证实了此方法的特异性。张清真等[22]以体外表达的S蛋白为包被抗原，商品化单抗为捕获抗体，对IgG进行生物素标记作为二抗，建立了检测PEDV的双夹心ELISA方法，该方法的最低检测限量为20 ng/μL ， 且稳定性和特异性较好。对25份临床猪腹泻样品进行PEDV

检测，3份检出为阳性，与RT-PCR结果的符合率为100%。王晨燕等[23]采用鼠源抗PEDV单克隆抗体为捕获抗体，以兔源多克隆抗体为检测抗体，建立了PEDV双抗体夹心ELISA方法，该方法与轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应，敏感度达30 μg/mL，与PCR检测符合率为92.30%。

3.4胶体金免疫层析技术

胶体金颗粒可以通过静电及其表面的物理特性与抗体、葡萄球菌蛋白A （SPA）等多种生物分子结合，形成蛋白质胶体金复合物，即胶体金标记物[24]。胶体金免疫层析技术因其具有操作简单、不需要昂贵的精密仪器、对检测人员的素质要求不高、有利于在基层推广等优点，目前已在许多领域得到了广泛应用，如肉食品药物残留检测[25]、粮食霉菌毒素的检测、抗原抗体检测、兽医疾病诊断等。魏艳秋[26]应用杂交瘤技术，以制备的N蛋白特异性单克隆抗体为材料，建立了检测PEDV的胶体金免疫层析方法，并用RT-PCR的方法对13份不同地区采集的猪小肠样品进行检测，发现这2种方法的阳性检出率分别为38.46%（5/13）和 46.15%（6/13），阳性样品的总符合率为83.5%。张利勃等[27]将基因工程表达的PEDV M蛋白抗原作为检测线，自制的抗葡萄球菌蛋白A（SPA）多抗血清包被硝酸纤维素膜作为质控线，对葡萄球菌蛋白A（SPA）进行胶体金标记作为指示介质，制成了检测PEDV感染猪血清抗体的快速检测试纸，并与ELISA检测方法进行比较，二者有相似的灵敏度，75份样品中有65份阳性、7份阴性，符合率达96%。

安徽农业科学2018年

4分子生物学检测方法

4.1核酸探针技术

核酸探针技术是20世纪70年代在基因工程学的基础上发展起来的[28]，在生化分析、分子药理学、动物疾病检测及进出口贸易检测等领域得到广泛应用。随着科学技术的进步，新的核酸探针技术也得到了快速发展，目前探针的种类有DNA探针、RNA探针、寡核苷酸探针和新型光学核酸探针[29]。Kim等[30]将已知序列的核苷酸用地高辛进行标记，在特定条件下与人工感染仔猪PEDV的N蛋白的基因进行碱基配对，结果发现PEDV检出率为9333%（14/15）。Jung等[31]利用基于RT-PCR建立的斑点杂交技术，采用地高辛标记过的cDNA探针同时对PEDV和TGEV感染后的猪粪便样品进行检测，检测结果与RT-PCR检测结果相一致，且敏感性更高。

4.2聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis发明的一种可在体外扩增特定基因或RNA序列的技术。PCR技术操作简单，结果可靠，目前已被广泛应用于医学、农学、考古等领域进行基因研究和分析。随着对PCR技术研究的加深，在传统PCR的基础上又衍生出多种PCR技术。这些技术包括实时荧光定量PCR、多重PCR、套式PCR、纳米PCR，PCR技术已经成为研究PEDV的基本技术手段并得到广泛应用。李劼[32]利用RT-PCR方法扩增从仔猪临床病料中分离出的一株PEDV（CHM2013），对其进行全基因组序列测定，并通过绘制进化树，CHM2013属于PEDV的G1亚群，与经典毒株CV777、SM98、DR13属于同一亚群，全基因组同源性为97.9%～99.9%，同时基于PEDV毒株CHM2013和分离出的强毒株BJ-2011-C的全程基因组设计引物，进行分段扩增，为进一步研究S基因突变对弱毒株在体外增殖和致病性的研究提供了技术支持。石坚等[33]根据GenBank中当前流行毒株S基因序列设计了2条特异扩增引物，建立了一套能够区分PEDV变异毒株和经典毒株的套式RT-PCR方法。此方法不仅能检测出PEDV，而且能快速鉴定毒株是否发生了变异，并且不会受其他非特异性产物的影响，灵敏度也较高。施开创等[34]建立了能够区分PEDV经典株、变异株及疫苗株的多重PCR方法，并与猪的其他病毒[如传染性胃肠炎病毒（TGEV）、轮状病毒（RV）、猪瘟病毒（HCV）、伪狂犬病毒（PRV）]无交叉反应。刘琪等[35]建立了一种能够快速区分PEDV疫苗毒株与野毒株的巢式PCR方法，该方法能够对PEDV与TGEV、RV、HCV、PRV等进行鉴别。沈思思等[36]采用靶向PEDV S基因的引物和探针，建立了检测PEDV的恒温隔绝式PCR（iiPCR），结果表明该方法的特异性和灵敏性与实时荧光定量PCR方法相当，使用的恒温隔绝式PCR检测仪比传统的PCR仪反应效率高，其反应总过程只需42 min，此外一键操作，无需设置反应条件，操作简单，结果易判读，对操作人员素质要求不高，无需电泳，减少了交叉污染和人为因素的影响。邢娜[37]通过系统化筛选TGEV和PEDV特异性探针并进行优化，分别标记于磁性颗粒和纳米金颗粒上，形成MMPs-RNA-AuNPs“三明治”复合物，将病毒核酸信号进一步扩大，并利用特殊引物通过PCR检测特异性，分别建立了特异性针对TGEV和PEDV基于纳米颗粒的超敏检测方法（ultrasensitive nanoparticle DNA probebased PCR assay，UNDP-PCR），并在此基础上又建立了同时检测TGEV和PEDV的双重UNDP-PCR检测技术。

4.2.1實时荧光定量PCR。

实时荧光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）是在标准PCR的基础上发展起来的检测技术，该技术是采用荧光探针或SYBR Green Ⅰ 荧光染料通过连续监测荧光信号强弱的变化来判断特异性产物的量。李亚青[38]根据GenBank中PEDV的CV777株及Attenuated DR13株ORF3基因序列设计了一对特异性引物，并以野毒株和疫苗毒的cDNA为模板，优化了引物浓度和退火温度，构建了Eva Green荧光定量RT-PCR方法，并经过多次验证，特异性和重复性好。此外，还可以对感染PEDV病猪的心、肝、脾、肺、肾、淋巴结和肠组织中的PEDV含量进行了定量分析。劳秀杰等[39]根据PEDV N基因设计了一对引物，利用SYBR Green I荧光染料建立了SYBR Green实时荧光定量RT-PCR检测方法，对同一样品3次重复试验，变异系数小于0.9%，最低检测限为1×100copy/μL，比常规PCR敏感度高100倍（1×102copy/μL），特异性强，标准曲线线性关系好，相关系数为1.0，扩增效率为105.4%。刘邓等[40]建立了多重实时荧光定量RT-PCR方法，并对PEDV、TGEV和RV进行鉴别检测，结果发现该方法具有较高的敏感性、特异性和重复性。

4.2.2纳米PCR。

纳米PCR是纳米技术与生命科学交叉的成果。2005年中国科学院应用物理所与上海交通大学首次报道了纳米金粒子（Au nanoparticles）对 PCR 反应的优化作用[41]。沈鹤柏等[42]将引物连接到金纳米颗粒表面，研究基于纳米金颗粒的PCR，将均相体系中的 PCR 技术扩展到纳米粒子表面。目前，纳米PCR已经在生命科学、动物医学等领域得到广泛应用。朱禹[43]根据PEDV和TGEV N基因的核苷酸序列分别设计了2对引物并扩增N基因，以pMD18-T为载体，与N基因连接作为标准质粒，设计出特异性引物，以特异性引物为模板，优化退火温度和引物的量，建立纳米PCR方法。灵敏性试验表明，质粒PEDV-N、TGEV-N的最低检出量分别为7.6×101和8.5×101copy/μL。敏感性试验表明，普通PCR检测的病毒RNA最低量为2.4×10-3和1.7×10-2 μg/mL，纳米PCR结果比普通PCR敏感 10倍。通过理论计算可得到纳米PCR检测PEDV及TGEV的最低量达到100.5 TCID50/mL，以其他多种病毒 PPV、PCV-2、PRRSV、PRV、CSFV和 H1N1作为检测对象，进行特异性试验，结果均未扩增出任何条带。利用纳米PCR的敏感性和特异性，用于临床诊断和流行病学调查，为PEDV的早期诊断提供了新的方法。

4.3環介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术最早由Notmi等[44]于2000年创建，是一种体外扩增特异性基因片段的分子生物学技术，该技术被广泛应用于核酸检测的各个领域，如病原体的识别、生物标志物检测、性别鉴定等。在常规LAMP扩增的基础上，各国学者对其进行了改进并开发出一系列多重LAMP扩增技术，如微型扩增技术以及实时荧光环介导技术。罗亚坤等[45]针对PEDV N基因设计了6条引物并对LAMP反应体系和反应温度进行了优化，建立了检测PEDV的环介导等温扩增法，结果发现其检测限量为91 copy/mL，是常规PCR检测方法敏感性的100倍，并与RT-PCR方法检测的75份临床样品进行对比，发现这2种方法的检测符合率为97.3%。田野等[46]也建立了检测PEDV的逆转录环介导等温核酸扩增（RT-LAMP），是在原反应液中加入一定量的逆转录酶，实现了RNA的一步扩增。时建立等[47]针对PEDV S基因设计特异性引物，建立了快速检测PEDV的LAMP方法。此方法特异性好，敏感性强，将反转录后的病毒cDNA稀释到108倍仍可检出。

5小结

猪流行性腹泻的早期诊断和猪群抗体水平的检测，在生产上对疾病的预防与控制起着关键性作用，因此选择一种可靠的、敏感性和特异性高、易于操作和检测成本相对低的检测方法也十分重要。随着科学技术的发展，PEDV的检测方法也有了显著进步，涉及免疫学、分子生物学等领域。目前，酶联免疫吸附实验（ELISA）和聚合酶链式反应（PCR）这2种方法在临床上的应用较为普遍，尤其是PCR方法（多重PCR、套式PCR、荧光定量PCR）与ELISA方法相比灵敏性和特异性更高，但对仪器设备要求高，对操作人员素质也有一定要求，特别是荧光定量PCR在设备和人员上要求更加严格，这使得该方法在基层生产中的推广有一定的限制。使用任何一种方法都很难对疾病做出确切诊断，可根据现有情况选择可靠性、准确性高的2种或2种以上的方法进行联合诊断。随着科学技术的不断进步，相信未来会出现一种检测迅速、操作简单、成本相对较低、可靠性和准确性高的新检测技术，从而为猪流行性腹泻的诊断、流行病学调查和防控奠定基础。

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