柞蚕核型多角体病毒基因组编码的VmiRNA筛选及功能分析

刘丹梅 宋丽新 李文利

摘要 [目的]VmiRNA不仅可以控制自身基因，还可调节宿主的稳定表达，研究VmiRNA的功能有助于从分子水平说明核型多角体病毒与柞蚕的寄生关系，从而改进对病毒的防控措施。[方法]利用生物信息学及实时定量PCR等分子生物学相关技术，对柞蚕核型多角体病毒编码的miRNA及其作用的靶标基因进行研究。[结果]经预测和筛选得到了ApNPV编码的miRNA MD217，与其有关的宿主靶基因14种，主要参与细胞组成、生化过程以及分子功能等途径，涉及到生物体细胞内一些催化、免疫反应等过程；实时定量PCR结果表明，MD217在病毒感染后上调表达，脂肪体组织内的靶基因MAPKK7表达水平与MD217的表达呈正相关。[结论]miRNA MD217在病毒感染后诱导表达，推测很可能降低了宿主免疫系统的防御能力，并同时影响靶基因MAPKK7的功能表达，从而避免了在免疫应答过程中的免疫清除。

关键词 柞蚕；核型多角体病毒；miRNA；靶标基因

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）23-0065-04

Abstract [Objective] VmiRNA can not only control its own gene，but also regulate the stable expression of the host.Studying the functions of VmiRNA can help to explain the parasitic relation between nuclear polyhedrosis virus and Antheraea pernyi on molecular level，thus improving preventions and controls of the virus.[Method] In this study，molecular biological techniques such as bioinformatics and Quantitative Realtime PCR were employed to research the miRNA of Antheraea pernyi nuclear polyhedrosis virus and its target gene.[Result] The miRNA MD217，which was encoded by ApNPV，was obtained by predicting and screening.The analysis showed that there were 14 host target genes related to MD217，and they were mainly involved in cell composition，biochemical processes，molecular functions and so on.They also referred to some processes in biological cells，such as catalysis and immunoreaction.The results of the Quantitative Realtime PCR showed that after the virus infection，MD217 upregulated the expression，and its expression was positively corrlated with the target gene MAPKK7 in adipose tissue.[Conclusion] The expression of miRNA MD217 was induced by virus infection.It was speculated to decrease the defense ability of the host immune system and affect the functional expression of the target gene MAPKK7 at the same time，thus avoiding the immune clearance in the immune response.

Key words Antheraea pernyi；Nuclear polyhedrosis virus；miRNA；Target gene

柞蚕核型多角体病毒（ApNPV）是柞蚕脓病的病原微生物[1]，属杆状病毒科包含体杆状病毒亚科，核型多角体病毒属。杆状病毒是杆状的包膜病毒，具有环状双链DNA，长度为80～18 000 kb，这些病毒感染了超过600个寄主物种，主要寄生于节肢动物中的鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫中[2]。杆状病毒与宿主细胞相互作用机理研究，包括在病毒进入和结合时的相互作用，宿主基因表达调节，以及修饰与调节细胞和机体所发生的生理和防御的相互作用的复杂和微妙的机制等[3]。

MicroRNA简称miRNA，是真核生物中非编码的内源性小分子RNA，是由茎环结构前体物质在核内经过一系列核酸酶的剪切运输到核外加工成熟形成的[4-5]，其本身不参与蛋白质的编码[6]，但却参与剪切、降解、抑制翻译以及染色体修饰等生物过程[7]。miRNA通过与靶标的结合程度不同来实现调控功能[8]，当miRNA与其靶标完全或近乎完全互补时，会引起mRNA降解而降低其表达；当两者不完全互补时，主要通过抑制靶标mRNA的翻译起作用[9]。

目前关于

核型多角体病毒编码miRNA的研究还较少。2011年，陈蔚等[10]利用Vmir软件成功地预测5条家蚕核型多角体病毒（BmNPV）编码的miRNA成熟体序列，经试验分析得到6条成熟体序列，推测其可能参与并调节了病毒感染宿主的過程，但未进行试验验证。Zhang等[11]利用miRNA的调控机理，构建了以BmNPV基因lef-1为靶基因的人工miRNA表达系统，成功利用RNA干扰技术产生了具有抑制病毒复制并降低病毒感染的成熟amiR2764和amiR279。李文利等[12]于2013年利用建立的柞蚕基因转录组数据库和基因组GSS数据库，在研究柞蚕核型多角体病毒编码的miRNA靶基因时发现135个与柞蚕免疫相关的基因，研究表明这些基因主要参与免疫系统的发育、免疫应答和免疫调节等过程。

笔者通过生物信息学方法和分子生物学相关技术，对ApNPV编码的miRNA进行筛选，并对VmiRNA的靶标基因进行预测；通过靶标基因功能分析及实时定量PCR验证，期望明确ApNPV与宿主miRNA之间的关系，并为柞蚕脓病的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 柞蚕青6滞育蛹、柞蚕核型多角体病毒均由大连理工大学生命科学与技术学院实验室提供。

1.2 miRNA的前体预测

采用VMir Analyzer（version 2.3）软件进行miRNA的前体预测。首先将ApNPV基因组（GenBank登录号：NC_008035）导入VMir软件中，设定序列最低得分150，最低窗口值35为条件初步筛选出病毒基因组编码的miRNA前体序列。在RNAshapes软件中得到前体序列的二级结构，并利用RNAhybrid分析这些序列的最小折叠自由能等参数，预测候选的miRNA。依据保守性区域的变化、5端首个碱基U存在等条件，利用Mireap得到预测的成熟体序列。

1.3 miRNA的靶基因预测与功能分析

采用RNAhybrid在线预测软件（http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybridwelcome.htlm）预测miRNA靶基因。在软件的窗口中输入miRNA序列和柞蚕cDNA文库的序列，经过分析得到相关的靶基因。将预测得到的miRNA靶标基因序列导入Blastx中，与NCBI蛋白质数据库已经收录的蛋白质序列进行比对得到序列相似性较高的蛋白质序列，并根据该已知蛋白质的功能注释分析靶标基因的功能，从而得到靶基因的功能信息，并对靶基因进行分类。

1.4 柞蚕脂肪体总RNA提取及cDNA合成

将ApNPV接种在柞蚕蛹脂肪体内，收集已发病的脂肪体组织，放入液氮中研成粉末，参照miRNeasy Mini Kit试剂盒（TaKaRa公司）说明书进行柞蚕脂肪体总RNA的提取，于-70 ℃保存备用。

利用PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒（TaKaRa公司）进行反转录生成cDNA，过程参照说明书进行。

1.5 预测得到的前体序列的检测

利用前体序列设计上下游引物，以脂肪体总RNA反转录合成的cDNA为模板，5s rRNA为内参，进行反转录PCR检测。反应条件如下：94 ℃预变性1 min；94 ℃变性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共30个循环。

将PCR电泳条带回收，制备阳性克隆并进行基因测序，将预测的序列信息与测序结果进行比对。

1.6 miRNA的表达分析

根据预测所得miRNA MD217序列设计上游引物（F-5′-TTGTGCTTGAAAAACGTAATCTATT-3′）；以SYBR primeScript miRNA RT-PCR kit 試剂盒的通用引物为下游引物（R-5′-GTTTTTCAAGAATGGCTGTACTCGA-3′），以柞蚕蛹脂肪体总RNA反转录的cDNA为模板，利用TP900实时荧光定量PCR仪，进行实时定量分析。

1.7 VmiRNA靶基因表达分析

根据预测得到的靶基因MAPKK7序列设计引物（F-5′-TGCTTCCGAGAAACGTAAGG-3′；R-5′-GTTCTTGTTCCTGATGTGGATTT-3′），以柞蚕蛹脂肪体总RNA反转录生成的cDNA为模板，以β-Actin 作为内参，进行实时定量PCR检测，反应条件：95 ℃变性30 s；95 ℃退火5 s；60 ℃延伸30 s，共40个循环，每组数据重复3次。并与miRNA的实时定量PCR结果进行同步对比。

2 结果与分析

2.1 预测得到的VmiRNA前体序列及其二级结构特征 在Vmir Viewer中设置发夹结构大于150 nt，长度70～165 bp，得到正链上的5个VmiRNA。应用RNAfold分析这些VmiRNA分子前体序列二级结构，这些预测得到的二级结构均含有茎环结构，最小折叠自由能为-23～-60 kJ/mol的有3个VmiRNA，平均值为-33.97 kJ/mol（表1）。

通过与测序结果进行对比分析，利用RNAshapes得到VmiRNA的二级结构，主要依据二级结构不同区域序列保守性的变化、5′端首个碱基U的存在、内部环和泡状区域的对称性、miRNA序列与末端环之间（2～9 nt）的保守性互补碱基对等筛选出VmiRNA MD217（图1），并利用MD217进行后续试验。

2.2 miRNA前体序列MD217的鉴定

以预测得到的MD217前体序列及成熟体序列为基础设计引物，对已经被ApNPV感染的柞蚕脂肪体组织的RNA进行PCR扩增。在2%琼脂糖凝胶电泳中鉴定PCR产物，得到与预测的VmiRNA前体MD217分子量相符合的条带（图2）。将回收产物测序，经过与ApNPV基因组序列比对，得到的结果一致，推测这条序列就是ApNPV编码的VmiRNA MD217前体序列。

2.3 VmiRNA MD217的靶标基因预测及表达分析

运用RNAhybrid软件对成熟VmiRNA MD217的宿主靶标基因进行预测，结果找到多个靶标基因，这些靶标基因主要有14种（图3），分为细胞组成、细胞过程等方面，参与细胞内免疫系统、分析结合、酶催化反应等过程。其中，与免疫系统相关的有6个（表2），主要参与免疫调节、免疫应答等过程。

利用实时定量PCR的相对定量法分析预测得到的MD217成熟体及靶基因MAPKK7的表达情况（图4）。由图4可以看出，miRNA MD217在感染ApNPV后3 h表达量明显上升到最高，达25.06，而到了6 h时明显下降，并随着时间增加而逐渐减低；靶基因的表达水平与MD217的表达呈正相关。说明MD217在病毒感染后上调表达，作用于宿主靶基因后，miRNA上调了靶基因的表达，当miRNA水平提高时，靶基因水平也提高，随着miRNA水平的降低，靶基因的表达水平也降低了。

3 讨论

病毒miRNA（VmiRNA）是近年来被发现的一类由病毒及其宿主共同产生的分子，现在已经发现了超过200个VmiRNA。研究表明，病毒利用这些miRNA控制细胞和病毒基因的表达，病毒性感染对细胞miRNA表达谱有重要影响，而miRNA也可以增强它们的复制潜力[13]。

该研究通过Vmir预测筛选获得了ApNPV基因组编码的miRNA MD217前体序列，经过一系列试验验证结果与预期符合；对MD217成熟体序列及其作用的宿主靶标基因进行了功能预测，利用实时定量PCR实时监测MD217和其靶标基因MAPKK7的表达水平，通过Ct差值法对相对表达量进行了分析，结果显示在3 h后MD217的相对表达量随时间增加而逐渐降低。miRNA MD217在病毒感染后诱导表达，很可能是降低了宿主免疫系统的防御能力，并同时影响靶基因MAPKK7的功能表达，从而避免了在免疫应答过程中的免疫清除。

促丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联途径是一类在真核生物中广泛存在的重要的信号传导网络。经典的 MAPK 级联途径包括3个必需的激酶组分：MAPKKK、MAPKK和 MAPK，通过顺序磷酸化而发挥功能[14]。李国奇等[15]认为，MAPK信号传导通路是广泛存在于哺乳动物及植物体内的重要信号传导系统，其接受多种多样的生物刺激，通过多级级联式传导程序引发细胞的生长、繁殖、分裂、凋亡等生理过程，同时参与炎症、肿瘤等病理过程。他们的研究表明，MAPKK7 是肿瘤发生、发展与转移的抑制因素，关于MAPKK7 的进一步研究很可能推导出新的肿瘤诊治措施。虞朝辉[16]运用miRNA表达谱技术对小鼠肝脏缺血的研究表明，miR-370可能通过影响潜在靶标基因MAPKK3和MAPKK7的表达，进一步调节MAPK信号传导通路的信号分子，由此在肝脏I/R损伤和IPC中发挥调节作用。笔者在ApNPV上取得的数据与MAPK在植物和人体上的结论有相关性，同时也将丰富MAPK信号传导网络的研究。

越来越多的研究表明，miRNA参与对病毒侵染免疫反应的调控过程。不同昆虫及细胞感染不同病毒后，其miRNA表达谱多会发生显著变化，如棉铃虫（Helicoverpa armigera）幼虫[17]和草地贪夜蛾Sf9细胞[18]感染杆状病毒、家蚕幼虫感染质型多角体病毒（BmCPV）[19-20]等，它们miRNA表达谱的变化可能来自寄主本身的抗病毒反应，亦可能受病毒基因的调控而产生。

综上所述，病毒除了通过自身的一些基因与宿主发生相互作用外，亦可通过编码一些VmiRNA与宿主发生相互作用，通过VmiRNA调节宿主体内某些相关基因以及自身相关基因的表达，为病毒在宿主内的存在创造有利的生存环境。随着对ApNPV和miRNA的进一步探索，将全面地了解柞蚕和ApNPV之间的作用关系，并以此制订更好的柞蚕脓病防御措施。

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