黄鳍鲷海豚链球菌的分离·鉴定及药敏试验

王汉清 黄郁葱 林潮峰

摘要 [目的]鉴定引起黄鳍鲷眼球充血、肝肾肿大等病征的病原菌。[方法] 从发病黄鳍鲷肝肾组织中分离致病菌，并结合致病菌的形态特征、培养特性、生理生化特征及16S RNA基因测序进行鉴定，测定分离菌株的半数致死量（LD50）；通过药敏试验筛选对分离菌株敏感的抗生素。[结果]经鉴定分离菌株为海豚链球菌（Streptococcus iniae）。回归试验结果证实该分离菌株是引起此次黄鳍鲷发病的病原菌，其对黄鳍鲷的LD50为5.0×103 CFU/g。药敏试验结果表明，该分离菌株对头孢噻吩、头孢呋辛、头孢他啶和头孢曲松等抗菌药物有较高的敏感性。 [结论]研究结果可为黄鳍鲷海豚链球菌病的防治提供理论依据。

关键词 黄鳍鲷；海豚链球菌；分离；鉴定

中图分类号 S917.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）21-0100-03

Abstract [Objective] To identify the pathogen that caused bloodstream congestion， hepatorenal enlargement and other symptoms in Sparus latus. [Method] The pathogen was isolated from the liver and kidney tissues of diseased S. latus. Combined with its morphological characteristics， culture characteristics， physiological and biochemical characteristics and 16S RNA gene sequencing results，the pathogen was identified. LD50 of the isolated strain was determined and the sensitive antibiotics were screened out by drug sensitivity test. [Result] The isolated strain was identified as Streptococcus iniae. The results of the regression test proved that the isolated strain was the pathogen that caused the disease of S. latus. Its LD50 to S.latus was 1.84×104 CFU/g. The results of drug sensitivity test showed that the isolated strain was highly sensitive to cefthiaxone， cefuroxime， ceftazidime， ceftriaxone， etc..[Conclusion] The research could provide theoretical basis for the prevention and control of S. suis.

Key words Sparus latus；Streptococcus iniae；Isolation；Identification

黄鳍鲷（Sparus latus）又名阔黑鲷，隶属鲈亚目（Pencoidei）鲷科（Sparidae）鲷属（Sparus），为浅海近岸底栖鱼类，是我国海水养殖的重要品种之一，广泛分布于我国台湾、广东沿海、福建、浙江，俗称黄脚立、黄墙、赤翅等[1-3]。2017年湛江部分黄鳍鲷养殖区域暴发了以眼球充血突出、鳃盖內缘出血、剖检出现肝肾肿大及腹腔积液等症状为主要病征的疫情，传染速度快，死亡率较高，给养殖户造成了巨大的经济损失。笔者对此病的病原菌开展了分离与培养，利用生化鉴定及16S RNA基因测序进行比对，测定分离菌株的LD50，通过药敏试验筛选敏感抗生素，旨在為黄鳍鲷的病害防治提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 病料及试验鱼

病料采自湛江某养殖网箱发病黄鳍鲷；回归感染试验所用的健康黄鳍鲷购自湛江某育苗场，无病史，平均体质量约40 g，试验前在循环养殖系统中暂养7 d。

1.2 培养基与主要试剂

鲜血培养基、BHI培养基、新型微生物微量生化鉴定盒，购自广东环凯微生物科技有限公司；Ex TaqDNA 聚合酶、DNA Marker2000均购自上海生工生物工程技术有限公司；药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 细菌分离及形态特征观察

取发病养殖场具有典型病征的濒死鱼，无菌剪取少量肝肾组织接种于鲜血培养基上，28 ℃下培养18～24 h后，挑取优势菌落划线，分别接种于BHI平板和鲜血培养基，观察菌落形态，挑取典型菌落进行革兰氏染色并镜检。分离菌经液体培养基培养后进行菌种冻干，-80 ℃条件下保存。

1.4 细菌的生理生化鉴定

参照海豚链球菌的常规生理生化指标进行鉴定[4]，测定项目包括葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、松三糖、淀粉、山梨醇、阿拉伯糖、棉子糖、木糖、水杨苷、VP试验、过氧化氢酶、鸟氨酸和赖氨酸等微量生化反应。

1.5 系统发育学分析

使用细菌16S RNA基因的通用引物进行PCR扩增，参考朱飞舟等[5]的方法。16S RNA基因扩增的的正向引物（27F）为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，反向引物为ACGGCTACCTTGTTACGACTT。PCR反应体系（50 μL）如下：Ex TaqDNA 聚合酶（5U/μL，含Mg2+）0.5 μL、10×PCR缓冲液5 μL、dNTP 4 μL、10 μmol/L正向引物1 μL、10 μmol/L反向引物1 μL，DNA模板1 μL，37.5 μL ddH2O。PCR反应条件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，共32个循环；72 ℃ 延伸7 min。PCR产物采用Gel Extraction Kit回收后，送交上海生工进行测序，测序结果经Blast分析后，构建基因进化树。

1.6 毒力测定

将试验黄鳍鲷（平均体质量约40 g）分为5个浓度梯度的攻毒组和1个对照组，每组试验鱼20尾。将试验黄鳍鲷饲养在循环式养殖系统中，水温控制在30 ℃，攻毒后饲养观察7 d，每天记录其游动、进食及死亡的情况。攻毒组剂量分别为1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106和1.0×107 CFU/尾，每尾腹腔注射0.1 mL；对照组注射PBS，每尾腹腔注射0.1 mL。对死亡试验鱼进行剖检，利用改良寇氏法计算出该菌株的半数致死量（LD50）。

1.7 药敏试验

采用纸片扩散法（K-B法）[6]进行药敏试验。将新鲜培养菌液均匀涂布于BHI平板上，取妥布霉素等28种常见抗生素药敏纸片均匀贴于平板表面，置于28 ℃培养箱中培养18～24 h，测量记录平板上抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 发病症状与流行情况

发病鱼水面打转、眼球充血突出，鳃盖內缘出血，鳍基出血，肛门发红，鳃贫血；解剖腹腔有腹水，肝肾肿大、充血；肠道充血，内有透明积液；脑部充血或出血。该病于5月份开始发病，流行范围广，传染性强，发病率和死亡率高，6—7月水温升高至30 ℃以后死亡率为50%～80%，给养殖业造成严重的经济损失。

2.2 分离菌的形态特征

从患病鱼的溃疡分离到1株优势菌株，命名为ALZJ07株。在BHI培养基上28 ℃培养24 h的菌落呈乳白色、表面光滑、圆形，中央隆起，直径约0.7 mm（图1）；在新鲜血琼脂平板上28 ℃下培养24 h的菌落呈β溶血、圆形、表面光滑的露珠样，直径约0.7 mm（图2）。革兰氏染色镜检呈革兰氏阳性球菌，多数呈链状排列，亦有单个或成对排列。

2.3 分离菌的生理生化特性

由表1可知，ALZJ07菌株可发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、松三糖和淀粉，不发酵山梨醇、阿拉伯糖、棉子糖、木糖、水杨苷，VP试验、过氧化氢酶反应和H2S反应呈阴性，鸟氨酸和赖氨酸呈阴性，精氨酸双水解酶显示为阳性等，基本符合海豚链球菌的生化特性。

2.4 系统发育树分析

为进一步确定该分离菌株ALZJ07的分类地位，测定其16S RNA的序列。经过Blast分析发现，ALZJ07与海豚链球菌的序列同源性在99%以上，根据测定ALZJ07所得的16S RNA基因序列与相关属种16S RNA基因序列构建系统发育树，可见ALZJ07与海豚链球菌聚为一支（图3），说明其与海豚链球菌的亲缘关系最近，可将ALZJ07确定为海豚链球菌。

2.5 毒力测定

根据攻毒后试验鱼死亡统计结果，进行LD50测定，测定结果见表2。根据测定结果，计算出ALZJ07菌株的LD50为5.0×103 CFU/g。对发病死亡的试验鱼进行外观检查和剖检，主要病变为鳃盖內缘出血，鳍基出血；解剖腹腔有腹水，肝肾肿大，肠道充血，内有透明积液。

2.6 药敏试验结果

采用纸片扩散法测定了病原株ALZJ07对28种不同药物的敏感性。由表3可知，分离菌株ALZJ07对头孢噻吩、头孢呋辛、头孢他啶、呋喃妥因、头孢曲松、左氟沙星、头孢呱酮、青霉素G、克林霉素、麦迪霉素、头孢唑林、四环素、氯霉素、氨苄西林、克拉霉素、氧氟沙星等高度敏感；ALZJ07对大观霉素、环丙沙星、诺氟沙星等中度敏感；对妥布霉素、卡那霉素、链霉素、多黏菌素B、阿米卡星、万古霉素、庆大霉素、氨曲南、复方新诺明等耐药。

3 结论与讨论

笔者通过对分离菌株的培养特性、形态学特征、生理生化特性、16S RNA测序分析，确定该分离菌株为海豚链球菌。1976年从患皮肤脓肿的亚马逊淡水海豚中首次分離出海豚链球菌，20世纪90年代后虹鳟、蓝子鱼、罗非鱼、条纹鲈、金头鲷和牙鲆等20多种养殖和野生鱼类中均有海豚链球菌的病例报道，认为其为引起鱼类链球菌病的主要病原菌[7-12]。

人工感染试验表明，分离菌株通过腹腔注射攻毒感染黄鳍鲷，感染后死亡率较高，当攻毒剂量大于1×107 CFU/尾时，试验鱼的死亡率达到100%，表明分离菌株具有较强的毒力，攻毒发病试验鱼与养殖现场观察到发病黄鳍鲷病征一致，主要病征符合海豚链球菌感染的特征[13]。这说明该分离菌为引发疫情的病原菌。

药敏试验结果表明，分离菌株ALZJ07对妥布霉素、卡那霉素、链霉素、多黏菌素B、阿米卡星、万古霉素、庆大霉素、氨曲南、复方新诺明等多种抗生素耐药。由于水产养殖中大量使用抗生素进行疫病的防治，导致病原菌耐药性日益增强，应该严格控制水产养殖中过度使用抗生素。沈锦玉等[14]应用海豚链球菌疫苗在大黄鱼上获得良好的免疫效果，海豚链球菌病的防治可以采用疫苗、有益微生物和生态防病等综合措施。

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