重组角质细胞生长因子(KGF)的原核表达及优化

田顺立 郑春阳

摘要 [目的]在原核表达系统中进行重组人角质细胞生长因子（KGF）的表达及优化。[方法]选取缺失N端23个氨基酸残基的KGF片段作为目的基因，按照大肠杆菌的密码子偏好性，将其进行密码子优化。使用BL21（DE3）菌株表达KGF（ΔN23）、SUMO融合的SUMO-KGF（ΔN23）和Fh8-SUMO融合的Fh8-SUMO-KGF（ΔN23），并测试不同表达温度（37、23 ℃）对KGF（ΔN23）表达结果的影响。[结果]在BL21（DE3）菌株中，37 ℃表达时KGF（ΔN23），SUMO-KGF（ΔN23）和Fh8-SUMO-KGF（ΔN23）的表达量都较高，其中可溶性蛋白表达量KGF（ΔN23）< SUMO-KGF（ΔN23）< Fh8-SUMO- KGF（ΔN23）。降低诱导温度为23 ℃后，3种KGF的表达量都显著降低，但是可溶性蛋白的占比显著提高，均接近100%。[结论]降低诱导温度能够促进KGF的可溶性表达，但是总蛋白的表达水平显著下降;与可溶性标签蛋白融合表达能够提高KGF在37 ℃表达时可溶性蛋白占比，其中融合Fh8-SUMO标签的KGF表达量和可溶性蛋白占比较高。

关键词 角质细胞生长因子（KGF）;原核表达系统;密码子优化;融合表达;标签蛋白

中图分类号 Q813;Q816文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）33-0071-04

角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）又称为成纤维细胞生长因子-7（fibroblast growth factor-7，FGF-7），是FGFs超家族中角质细胞生长因子家族中的一员。KGF最初是从人胚胎肺成纤维细胞系M426的培养上清中分离纯化出来的，具有促进小鼠角质细胞有丝分裂的作用[1]。后来的研究发现，KGF是由各种来源的间质细胞表达分泌的，其主要作用是促进各种类型上皮細胞的增殖和分化，在受损上皮细胞的修复和各种组织器官的伤口愈合过程中发挥着重要作用[1-4]。

人类KGF的cDNA编码产生具有分泌信号肽的194个氨基酸的蛋白质。从人成纤维细胞培养基中分离的天然KGF，其表观分子量为26～28 kD，而在大肠杆菌中重组表达的KGF，其表观分子量约为21 kD，这与KGF N末端附近的N-和O-连接的糖基化修饰有关[5-7]。重组表达的KGF，虽然没有经过翻译后修饰，但是仍具有生物活性，且其活性远远高于分离所得的天然KGF[5]。另外，有试验表明，删除KGF信号肽序列下游的前23个氨基酸残基，并不会改变KGF的活性，但是能够显著增加其稳定性[5，8]。

虽然KGF能够在哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞中产生，但是这些来源的蛋白存在交叉感染的风险性，且成本高、价格昂贵，导致KGF的药物应用受到很大的限制。相比之下，原核表达系统则具有一定的成本优势。但是，到目前为止，KGF在原核系统中的重组表达并未取得很好的成果，存在蛋白表达水平低、稳定性差的问题[5，9]。为了实现KGF在原核系统中的规模化生产，笔者拟在原核表达系统中进行重组人源KGF的表达及优化。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

大肠杆菌克隆菌株DH5α购买自北京全式金生物技术有限公司，表达菌株BL21（DE3）购买自Promega公司，表达质粒pET11a和pET28a均购自NEB公司，质粒pET28a-SUMO由笔者所在实验室改造构建。

1.2 KGF基因的合成

以人的角质细胞生长因子基因（GenBank：HF548201.1）作为原始序列，参照大肠杆菌的密码子偏好对基因序列进行密码子优化，然后由生工生物工程（上海）有限公司进行全基因合成。

1.3 原核表达载体的构建

以合成的KGF基因为模板，通过PCR扩增缺失信号肽下游N端23个氨基酸的KGF片段，所用引物为F1（5-TTTAAGAAGGAGATATACATGTCTTACGACTACATGGAAGGTGG-3）和R1（5-GCTTTGTTAGCAGCCGTCAGGTGATCGCCATCGG-3）。PCR产物经纯化后，通过重组克隆的方式连接到表达载体pET11a（经NdeI/BamHI线性化），得KGF片段的表达载体pET11a-KGF（ΔN23）。

以上述质粒为模板，通过PCR扩增KGF片段，所用引物为F2（5-GTGAACAGATCGGTGGTTCTTACGACTACATGGAAGGTGG-3）和R2（5-GAATTCGGATCCATGGTCAGGTGATCGCCATCGG-3）。PCR产物经纯化后，通过重组克隆的方式连接到表达载体pET28a-SUMO（经MscI线性化），得KGF片段的表达载体pET28a-SUMO-KGF（ΔN23）。

由金唯智公司合成编码Fh8的基因（210 bp，Genebank：AF213970），通过PCR将其扩增，所用引物为F3（5-GCCGCGCGGCAGCCATATGCCTAGTGTTCAAGAGG-3）和R3（5-AACTTCAGAGTCAGACATATGTGATGACAAAATCGAAAC-3）。PCR产物经纯化后，利用同源重组的方法连接到表达载体pET28a-SUMO-KGF（ΔN23）（经NdeI线性化），得重组表达载体pET28a-Fh8-SUMO-KGF（ΔN23）。

1.4 目的蛋白的诱导表达及检测

将上述构建好的表达载体，分别转入表达菌株BL21（DE3）中。挑取单克隆至含有50 μg/mL卡那霉素或100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养至OD600=0.4～0.6，加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG诱导后，继续37 ℃或23 ℃培养4 h，12 000 r/min离心2 min收集菌体。

用50 mmol/L Tris缓冲液（pH 8.0）将菌体重悬，超声破碎后离心，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝R-250染色并脱色后检测目的蛋白的表达情况。

2 结果与分析

2.1 角质细胞生长因子KGF基因的优化

为了提高角质细胞生长因子KGF在原核细胞中的表达水平，按照大肠杆菌的密码子偏好性，将其进行密码子优化，优化后基因序列如图1所示。

2.2 KGF片段的原核表达

根据报道，切除了N端23个残基的KGF蛋白稳定性显著提高，且活性不受影响[5，8]，所以笔者选取了缺失N端23个氨基酸残基的KGF片段作为目的基因，进行原核重组表达。结果发现，在BL21（DE3）菌株中，37 ℃诱导培养时，不含任何标签的KGF（ΔN23）能够表达，且表达量比较高，但是绝大部分蛋白以包涵体的形式存在，上清中的可溶性蛋白表达很少，不足10%（图2）。降低诱导温度为23 ℃后，KGF（ΔN23）几乎完全在胞质中可溶性表达，但是其总的表达量极少（图2）。

2.3 KGF片段原核表达的优化

为了提高KGF（ΔN23）的

可溶性表达，尝试将其与可溶性的标签进行融合表达。考虑到标签以及标签切除后残余残基可能对KGF的活性和稳定性造成一定影响，选择能够被ULP蛋白酶有效切除，且切除后无氨基酸残基残余的SUMO（small ubiquitinlike modifier）标签与其融合表达。结果如图3所示，与SUMO融合表达的KGF（ΔN23），在37 ℃诱导时，其表达水平显著提高，且上清中的可溶性表达也有所增加，但是在沉淀中，以包涵体形式表达的KGF（ΔN23）仍然很多，占总蛋白的50%以上。降低温度诱导时，KGF（ΔN23）几乎完全在胞质中可溶性表达，但是其总的表达量显著降低。

Costa等[10]的研究表明，強酸性标签蛋白Fh8不仅分子量小（8 kD），而且能够提高目的蛋白在原核系统中的可溶性表达。为了进一步增加KGF（ΔN23）在上清中的可溶性表达，在SUMO标签的N端增加了1个Fh8标签，这样既不影响SUMO蛋白酶对标签的切割，又能增加融合蛋白的可溶性。结果如图4所示，与Fh8-SUMO融合表达的KGF（ΔN23），在37 ℃诱导时，上清中的可溶性表达明显增加，达到总蛋白的50%以上，且总蛋白的表达水平也有所提高。降低温度诱导后，KGF（ΔN23）也几乎完全在胞质中可溶性表达，且其总的表达量也比较可观，根据SDS-PAGE估算，摇瓶培养可产目的蛋白20～30 mg/L。

3 讨论

随着研究的逐渐深入，各种细胞因子的发现及其调控机理的探明使人们认识到，细胞因子作为具有特定活性的调节蛋白，能够参与调控人体的各种生理功能。近年来，细胞因子作为一种新型的生物应答调节剂在临床应用上取得了令人瞩目的成就，同时，其在医疗美容行业的应用价值也正在逐步突显。

KGF作为纤维细胞生长因子超家族中的一员，能够促进上皮细胞的增殖和分化，对多种疾病，如肺水肿、消化道损伤、皮肤和角膜损伤都具有一定的治愈效果[11]。2004年，由美国Amgen公司开发的一种重组截短型的KGF（palifermin），已经被美国食品和药品管理局批准作为药物，用于降低血液恶性肿瘤患者在干细胞移植前接受高剂量辐射和化疗过程中黏膜炎的发病率，减少损伤的持续时间和严重程度[9]。目前，虽然KGF已经在原核系统中实现重组表达[5，9]，但是由于KGF蛋白表达水平和稳定性的限制，导致其生产水平降低，使药物应用受到很大的限制。

由于原核表达系统的低成本，该研究尝试在大肠杆菌中实现KGF的重组表达及优化。为了提高目的蛋白的稳定性，选取了缺失N端23个氨基酸的KGF片段作为目的基因，进行原核重组表达。通过密码子优化，可溶性标签融合表达，降低诱导温度等优化条件，来提高KGF在原核细胞中的表达水平，并促进其在上清中的可溶性表达。结果发现，降低诱导温度（如23 ℃）能够促进KGF的可溶性表达，但是总蛋白的表达水平显著下降;与可溶性标签蛋白融合表达不仅能促进KGF在上清中的表达，而且不会影响蛋白的总体表达水平，且标签可尝试在后期纯化过程中切除。

综上所述，在原核系统中进行KGF重组蛋白的优化表

达，仍然是一个成本低廉且快速有效的途径。该途径的深入研究与优化，有望提高KGF重组蛋白的生产水平，对实现KGF在临床与医疗美容行业的应用具有重要意义。

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