龙胆草抗氧化活性和总黄酮含量测定研究

李培源 霍丽妮 贾智若 卢澄生

摘要 [目的]探讨龙胆草3种提取物的抗氧化活性，并测定其总黄酮含量，研究其抗氧化活性和总黄酮含量之间的关系。[方法]采用乙醇、丙酮和乙酸乙酯3种溶剂，得到龙胆草3种提取物。采用DPPH自由基体系、还原能力体系评估提取物的抗氧化能力，测定其总黄酮含量，并探讨其抗氧化活性-总黄酮含量之间的关系。[结果]龙胆草提取物具有优异的抗氧化性能，总黄酮含量高的提取物具有更强的抗氧化能力。[结论]龙胆草可作为潜在的天然抗氧化剂进行开发和利用。

关键词 龙胆草；DPPH；还原能力；抗氧化；总黄酮含量

中图分类号 R284文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）31-0182-02

Abstract [Objective]To study the total flavonoid content and antioxidant activity of several extracts of Gentiana rigescens.[Methods]Three kinds of extracts of Gentiana rigescens were obtained by using three solvents of ethanol， acetone and ethyl acetate.The DPPH free radical system and reducing power system were used to evaluate the antioxidant capacity of the extract， and the total flavonoid content was determined， and the relationship between its antioxidant activity and total flavonoid content was discussed.[Result]The extract of Gentiana rigescens had excellent antioxidant properties， and the extract with high total flavonoid content had stronger antioxidant capacity.[Conclusion]Gentiana rigescens can be developed and utilized as a potential natural antioxidant.

Key words Gentiana rigescens；DPPH；Reducing power；Antioxidant；Total flavoniod

龍胆草（Gentiana rigescens）是龙胆科龙胆属植物，多年生草本，高30～60 cm，生于山坡草地、路边、河滩、灌丛中、林缘及林下、草甸，海拔400～1 700 m[1]，清热燥湿、泻肝胆火，可治湿热黄疸、阴肿阴痒、带下、强中、湿疹瘙痒、目赤、耳聋、胁痛、口苦、惊风抽搐。龙胆草在民间使用非常广泛，但其抗氧化方面的研究鲜见报道。近年来，寻找来源于植物的天然抗氧化剂成为研究的热点[2-6]。笔者通过测定龙胆草3种溶剂提取物（乙醇提取物、丙酮提取物和乙酸乙酯提取物）对DPPH自由基的清除能力和还原能力来对其抗氧化能力进行研究，为龙胆草作为一种天然高效抗氧化物推广利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试材

UV1901型紫外可见分光光度计（北京普析电子科技有限公司）。龙胆草采于广西百色，由广西中医学院壮药学院韦松基教授鉴定为龙胆科龙胆属植物龙胆草（Gentiana rigescens）。芦丁标准品购于百灵威试剂公司（北京）。所有试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 龙胆草不同溶剂提取物制备。

称取20 g龙胆草粉末，加入200 mL乙醇（95%），冷浸72 h。重复上述操作3次，合并提取液。旋转蒸发回收溶剂，得到龙胆草乙醇提取物（EE）0.7 g，得率为3.5%。同法，用丙酮及乙酸乙酯提取，得到丙酮提取物（AE）0.9 g和乙酸乙酯提取物（EAE）0.8 g，得率分别为4.5%和4.0%。

1.2.2 总黄酮含量测定。

1.2.2.1 标准曲线测定。

精密吸取芦丁对照品溶液（l mg/mL）0.1 mL于10 mL量瓶中，分别加5%亚硝酸钠0.4 mL，静置6 min，加入5%硝酸铝0.4 mL，静置6 min。加5%氢氧化钠试液4.0 mL，用95%乙醇稀释至刻度，摇匀。静置15 min，在510 nm处测定吸光度。以吸光度对溶液浓度进行回归分析，绘制标准曲线，得出回归方程。

1.2.2.2 龙胆草提取物总黄酮含量测定。

将芦丁标准溶液换为固定浓度提取物溶液，同“1.2.2.1”操作测定吸光度，多次测量求平均值。根据标准曲线计算总黄酮的芦丁当量，总黄酮含量以每克干物质的芦丁当量（mg）表示，并计算提取得率。

1.2.3 二苯基苦味肼基自由基（DPPH）体系[7]。

取不同浓度龙胆草提取物溶液（0.2、0.5、0.8、1.2 mg/mL）加入8 mL DPPH（0.004%）溶液中。在最大波长处（517 nm）测吸光度，直到平衡为止。清除率计算公式为S =（1-A样品）/A空白×100%。其中，A空白为未加药液的DPPH溶液的吸光度，A样品为加入药液的DPPH溶液的吸光度。

1.2.4 还原能力测定[8]。

取龙胆草提取物溶液，加入2.5 mL PBS溶液（pH=7.4）、2.5 mL KFe（CN）4（1%）。上述混合物于50 ℃恒温20 min后，加入2.5 mL三氯乙酸溶液（10%），离心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水，0.5 mL FeCl3（1%），混匀。在700 nm处测定吸光度，以蒸馏水为参比。

2 結果与分析

2.1 龙胆草提取物总黄酮含量测定结果

以吸光度对溶液浓度进行回归分析，绘制标准曲线，得出回归方程为：y=9.677 8x+0.016 7（R2=0.999 2）。根据线性方程计算出龙胆草乙醇提取物﹙EE﹚、丙酮取物﹙AE ﹚和乙酸乙酯提取物﹙EAE﹚的总黄酮含量。结果发现，龙胆草3种提取物均具有较高的总黄酮含量，其黄酮含量由高到低的顺序为EAE、AE、EE。AE和EAE的黄酮含量分别为51.6和58.9 mg/g，高于EE（21.2 mg/g）。

2.2 龙胆草提取物对DPPH自由基的清除能力

从龙胆草3种溶剂提取物（AE、EE、EAE）对DPPH自由基清除能力（图1）可以看出，AE、EE、EAE对DPPH自由基的清除率随提取物浓度增加而增大。EAE在浓度为0.5和0.8 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率分别为56.0%和61.5%；当EAE浓度增加至1.2和1.5 mg/mL时清除率增大为72.0%和73.9%；当EAE浓度增加至2.0 mg/mL时，清除率增大至79.7%。

在3种溶剂提取物中，AE在不同浓度下均表现出最强的DPPH自由基清除能力；在浓度为0.8 mg/mL时AE对DPPH自由基的清除率为72.2%，在浓度为1.2 mg/mL时清除率为75.2%，浓度为2.0 mg/mL时清除率为80.4%。AE在低溶液浓度下具有良好的DPPH自由基清除能力，在浓度仅为0.5 mg/mL时，AE对DPPH自由基的清除率也达到了67.8%。EAE在浓度为0.5 mg/mL时对DPPH自由基的清除率约为55.0%，随着浓度增加，其对DPPH自由基的清除率显著增加。在较低溶液浓度下（0.5 mg/mL），3种溶剂提取物对DPPH自由基清除能力的顺序为AE>EAE>EE，在较高溶液浓度下，其对DPPH自由基清除能力的顺序为AE>EE>EAE。

2.3 不同溶剂提取物EC50值

半抑制浓度（EC50）表示抗氧化剂对自由基清除率达到50%时的质量浓度，因此，EC50的数值越小，则表明抗氧化剂对自由基的清除能力越强。龙胆草3种提取物对DPPH自由基均表现出较低的EC50值，EE、AE和EAE对DPPH自由基的EC50值分别为0.45、0.01和0.12 mg/mL，对DPPH自由基均具有良好的清除效果。值得指出的是，AE对DPPH自由基的EC50值低至0.01 mg/mL，表明其对DPPH自由基的清除能力优异。

2.4 龙胆草提取物的还原能力

从图2可看出，在较低浓度下（0.5 mg/mL）下龙胆草3种溶剂提取物的还原能力相似，EAE、AE和EE的吸光度分别为0.35、0.32和0.31；同时，3种溶剂提取物的还原能力均与其浓度相关，随提取物浓度增加而增大。对于AE，浓度为0.5和0.8 mg/mL时吸光度分别为0.32和0.36，浓度为1.0和1.2 mg/mL时吸光度分别为0.40和0.46，当AE浓度为2.0 mg/mL时吸光度为0.78。3种提取物中，EAE的还原能力最强，浓度为0.8 mg/mL时吸光度为0.50，浓度为1.5 mg/mL时吸光度为0.79。在最高浓度2.0 mg/mL时EAE吸光度达到0.84，而EE的还原能力最低，吸光度为0.55。可见具有较高总黄酮含量的AE和EAE均表现出很强的还原能力，表明龙胆草提取物的还原能力与总黄酮含量有关。

3 结论

该试验测定了龙胆科龙胆属植物龙胆草不同溶剂提取物的总黄酮含量，并通过DPPH自由基体系和还原能力来研究其抗氧化性能。结果表明，龙胆草不同溶剂提取物都具有较高的总黄酮含量，其中AE和EAE的总黄酮含量较高，分别为51.6和58.9 mg/g。3种溶剂提取物对DPPH自由基均显现出较强的清除能力，AE在浓度为2.0 mg/mL时清除率为80.4%，在浓度仅为0.5 mg/mL时，AE对DPPH自由基的清除率也达到了67.8%。同时，龙胆草提取物表现出较强的还原能力，还原能力顺序为EAE>AE>EE，该顺序与提取物总黄酮含量顺序一致，表明其优异的抗氧化能力与总黄酮含量有关。龙胆草不同溶剂提取物具有优良的清除自由基能力和抗氧化能力，具有作为天然抗氧化剂应用于各领域的潜力。

参考文献

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