1例种鹅大肠杆菌病病原的分离与鉴定

刘明生 甘辉群 袁橙 郝福星 康金龙 周国栋

摘要 从江苏兴化市某种鹅场有疑似大肠杆菌病的病死鹅中，通过细菌分离培养、形态学观察、生化试验、血清型鉴定，分离鉴定出鹅大肠杆菌，其血清型为O11；通过动物致病性试验，该菌株致病性中等毒力；药敏试验结果表明，所分离的大肠杆菌对氟甲喹、硫酸粘菌素、庆大霉素、阿米卡星高度敏感，这为临床防治鹅大肠杆菌病提供实验依据，并为制备鹅大肠杆菌自家苗奠定基础。

关键词 种鹅；大肠杆菌；分离鉴定；血清型；药敏试验

中图分类号 S858.33文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）31-0069-02

Abstract The Escherichia coli was isolated and identified from a goose farm in Xinghua City， Jiangsu Province， by bacteria isolation and culture， morphological observation， biochemical test， serotype identification， and the serotype of E.coli was O11.The pathogenicity of the strain was moderately virulent by animal pathogenicity test.The results of drug sensitivity test showed that the isolated E.coli was highly sensitive to flumequine， colistin sulphate， gentamicin and amikacin， which provided the experimental basis for clinical prevention and treatment of goose E.coli and laid a foundation for the preparation of goose E.coli vaccine.

Key words Breeding geese；Escherichia coli；Separation and identification；Serotype；Drug sensitive test

鹅大肠杆菌病为危害养鹅业的主要传染病之一，是由致病性埃希大肠杆菌所引起的，临床表现为心包炎、肝周炎、气囊炎、关节炎以及脑炎等，成年种鹅感染本病，可引起输卵管炎、卵黄性腹膜炎，俗称“蛋子瘟”，导致种鹅繁殖机能降低，甚至引发死亡，给种鹅养殖户带来较大的经济损失。笔者在社会服务过程中，多次遇到本病，现介绍一例种鹅大肠杆菌病病原的分离与鉴定过程，为鹅大肠杆菌病防治提供参考。

1 材料

1.1 病例介绍

2018年3月，位于江苏省兴化市的某一种鹅养殖场饲养的约2000只种鹅反复发病。据主诉，种鹅2～3岁，排稀软的水样粪便，逐渐消瘦，最后死亡；产蛋率下降，蛋的质量也下降，蛋壳粗糙，产软壳蛋，受精蛋率降低，出雏率降低；发病期间先后投喂过氟苯尼考、恩诺沙星、多西环素等抗菌药物，投药期间症状有所改善，但不能完全控制，仍有零星发病和死亡，造成很大的经济损失。

临床检查，发病母鹅表现精神差，羽毛乱，缩头闭眼，产蛋下降，产薄壳蛋、软壳蛋；食欲不振或者废绝，腹部膨大，且明显下垂甚至着地，运动缓慢，严重时如同企鹅姿势。多数病鹅排白色或黄白色稀便，肛门周围有粪便污染，脱水明显。发病公鹅症状主要表现在外生殖器上，如阴茎潮红、肿胀，严重者有坏死、溃疡和结节，影响交配。

病理变化，先后挑取病死鹅4只进行解剖，见病鹅消瘦，腹部膨大；切开腹部，可见腹腔内积聚大量淡黄色、浑浊的体液，混有破碎的卵黄。肝脏肿大，表面有淡黄色凝固的纤维素性渗出物覆盖，掀去覆盖物，见肝表面有針尖大出血点及灰黄色坏死点。肠系膜充血、出血，有的发生粘连。卵巢变形萎缩，呈灰色、褐色等。输卵管内见淡黄色或黄白色的纤维素性分泌物。

1.2 主要试剂

培养基：葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、硫化氢、柠檬酸盐、尿素、靛基质、 M.R、V-P等生化发酵培养基， 以及麦康凯培养基粉、普通营养肉汤培养基粉、营养琼脂培养基粉，均购自青岛日水生物技术有限公司。

大肠杆菌标准抗O血清及阴性血清：购自天津生物芯片技术有限责任公司。

药敏纸片：氟甲喹、庆大霉素、阿米卡星、多西环素、阿莫西林、新霉素、大观霉素、恩诺沙星、硫酸粘菌素、头孢噻呋、磺胺氯哒嗪、氟苯尼考等药敏纸片，根据参考文献[1]，按要求自己制备。

1.3 试验动物

由兴化市宇鹏鹅业养殖有限公司提供10日龄健康雏鹅20只，按正常免疫程序免疫，即雏鹅1日龄、7日龄分别皮下注射小鹅瘟抗血清0.5 mL，不使用任何抗菌药物。

2 方法

2.1 细菌分离培养

无菌取病死鹅的肝、脾、卵黄、输卵管分泌物等，分别划线接种于普通营养琼脂及麦康凯琼脂平板培养基上，置37 ℃培养箱，培养18～24 h，观察菌落特征。然后，选取在麦康凯琼脂平板上生长良好的粉红色或红色菌落，继续接种于营养琼脂斜面上，置37 ℃培养箱，培养18～24 h，进行纯培养，备用。

2.2 形态学观察 对分离的菌株进行革兰氏染色，镜检，观察细菌形态特征。

2.3 生化鉴定 按文献[2]介绍方法，取纯培养后的细菌进行常规生化试验。

2.4 血清型鉴定 参考文献[3]，制备大肠杆菌O抗原，并对分离菌株进行血清型鉴定。

2.4.1 菌株O抗原的制备：用0.5%石炭酸生理盐水适量，将上述营养琼脂斜面上的纯培养物洗下，制成浓稠菌悬液，细菌浓度约 1×1010个/mL，集于小瓶中，于高压灭菌器中作用2 h，以破坏其K、H 抗原，制成O抗原，保存于4 ℃冰箱。

2.4.2 菌株 O抗原的鉴定：先用玻板凝集试验，初步筛选可能的O血清型，然后通过试管凝集反应对O 血清型进行鉴定，定型标准为血清试管凝集价不低于1∶640。

2.5 致病性试验

另用生理盐水将营养琼脂斜面上菌苔洗下，以平板计数法计算活菌数，再用生理盐水调整细菌数，使浓度约为1×109 个/mL。将20只10日龄雏鹅随机分成2组，每组10只，第1组为试验组，每只皮下注射菌悬液0.5 mL，第2组为对照组，每只皮下注射生理盐水0.5 mL。注射后继续饲养，48 h内观察临床症状，并记录死亡数。之后，无菌操作取病死鹅的心血、肝划线接种于麦康凯琼脂平板上，并对分离出的菌株进行进一步鉴定。

2.6 药敏试验

选取12种药敏纸片，氟甲喹、硫酸粘菌素、庆大霉素、阿米卡星、氟苯尼考、磺胺氯哒嗪、多西环素、阿莫西林、新霉素、大观霉素、头孢噻呋、恩诺沙星，按K-B纸片扩散法[1]进行药敏试验。判定标准：抑菌圈直径大于15.1 mm为高度敏感，直径在10.1～15 mm为中度敏感，小于10 mm为低度敏感或耐药。

3 试验结果

3.1 细菌分离 病料在普通琼脂培养基上长出圆形、灰白色、光滑、湿润、边缘整齐的直径1～2 mm的不透明菌落；在麦康凯琼脂培养基上长出中等大小圆形、粉红色、表面光滑，湿润的菌落。

形态学观察，所分离的细菌为单个或成丛的革兰氏阴性短小杆菌，菌体两端钝圆，与大肠杆菌的形态特征相符。

3.2 生化鉴定

所分离的菌株可发酵麦芽糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇，均可产酸产气，大多数菌株不利于蔗糖，少数菌株缓慢发酵。枸橼酸盐试验和V-P 试验结果均为阴性，M.R.试验和吲哚试验均为阳性。

3.3 血清型鉴定结果 经过多因子和单因子鉴定，本次从该鹅场分离的菌株经血清型鉴定为O11。

3.4 致病性试验结果 试验组于48h内出现排稀粪症状，精神稍差，采食减少，48 h仅死亡2只，死亡鹅剖检具有典型的鹅大肠杆菌病变特征，其余鹅只剖检见气囊浑浊或无病变；而对照组无临床症状，全部存活。将试验组2只病死鹅解剖，无菌采集心脏或肝脏，划线接种于麦康凯琼脂平板，37 ℃培养箱培养24 h ，结果在麦康凯琼脂平板上生长为粉红色圆形菌落。

3.5 药敏试验结果 对该养殖场分离鉴定的大肠杆菌进行药敏试验，结果见表1所示。从表1可以看出，从该养殖场分离鉴定的大肠杆菌对氟甲喹、硫酸粘菌素、庆大霉素、阿米卡星高度敏感，抑菌圈直径>15 mm；对氟苯尼考、磺胺氯哒嗪、多西环素中度敏感，抑菌圈直径为12～13 mm；对阿莫西林、新霉素、大观霉素、头孢噻呋、恩诺沙星低度敏感或耐药，抑菌圈直径<10 mm。

4 小结与讨论

4.1 大肠杆菌鉴定

對该种鹅场的发病，通过病史调查、临床症状、病理变化，初步诊断为大肠杆菌病；细菌培养特征、形态特征、生化特性及血清学结果表明，所分离的菌株为大肠杆菌，其血清型为O11；小鹅的致病性试验结果表明，已鉴定的大肠杆菌血清型O1 其致病力中等，但对种鹅却引起了排稀粪，产蛋下降，种蛋孵化率低下等症状，造成养殖户重大经济损失。本实验血清型的鉴定，也为下一步制备大肠杆菌自家苗防治本病奠定了基础。

4.2 药物敏感试验 我们对该养殖场分离的菌株用临床常用的12 种抗菌药物进行药敏试验，结果表明，本次分离菌株对氟甲喹、硫酸粘菌素、庆大霉素、阿米卡星高度敏感，而对氟苯尼考、多西环素、阿莫西林、头孢噻呋等抗菌药物的敏感性降低，这可能跟该养殖场的用药习惯有关。据了解，该养殖场未曾使用过氟甲喹、硫酸粘菌素、庆大霉素、阿米卡星，而氟苯尼考、阿莫西林、头孢噻呋等却频繁使用，这与宦海霞[4]、植婵萍[5]等报道的基本一致。

4.3 鹅大肠杆菌病防治

第一，要加强生物安全管理，对鹅舍和场地进行定期喷洒消毒，种蛋进行浸泡或熏蒸消毒；必须严格控制进出饲养场的人员、车辆、设备、用具等流动，定期灭蚊，灭蝇、灭鼠；要减少配种传播，公鹅在配种前应逐只检查，凡外生殖器有潮红、肿胀、坏死、溃疡等病变的一律淘汰，不能留着种用[6-7]。

第二，对本病的治疗，选用高敏药物治疗，如10%氟甲喹可溶性粉500 g，对水2 000 kg，全天集中1次饮服，连用4 d。随后可改用中草药制剂，如黄芩解毒散300 g，拌料1 000 kg，再连用4 d，取得了很好的治疗效果。

第三，对本病的预防，除了加强饲养管理外，有条件的最好做自家灭活苗，对鹅群进行免疫接种，能有效保护鹅群健康，降低致病性大肠杆菌的传播。之后定期用微生态制剂或黄芩解毒散等中草药添加剂拌料，调节肠道菌群平衡，维护肠道健康。

参考文献

[1] 马兴树.禽传染病实验室诊断技术[M].北京： 化学工业出版社，2006.

[2] 白文彬，于康震.动物传染病诊断学[M].北京：中国农业出版社，2002.

[3] 刘明生，甘辉群，陆桂平，等.海安县鸡大肠杆菌病病原的分离鉴定及多价灭活苗的研制[J].黑龙江畜牧兽医，2010（21）：98-100.

[4] 宦海霞，苗晓青，周琼，等.江苏省部分地区鹅源致病性大肠杆菌的分离、鉴定和耐药性分析[J].饲料工业，2007，28（15）：62-64.

[5] 植婵萍，贺丹丹，陈孝杰，等.种鹅大肠杆菌分离鉴定及耐药性分析[J].中国畜牧兽医，2014，41（9）：245-249.

[6] 张其升.鹅大肠杆菌病的危害及防控[J].中国畜禽种业，2016，12（8）：151-152.

[7] 许国平，顾旭萍.鹅大肠杆菌病综合防治之我见[J].中国畜牧兽医文摘，2017，33（12）：16 227.