那西肽高产菌株选育

李依韦 张璐璐 代玉坤

摘要 [目的]选育那西肽高产菌株。[方法]游动放线菌通过紫外诱变与化学诱变，对诱变菌株进行那西肽发酵，测定不同发酵条件下那西肽含量。[结果]对比发酵那西肽产量高低获得1株发酵那西肽高产菌株zLL。zLL菌株在豆粉40 g/L、淀粉酶0.4 g/L、淀粉70 g/L、（NH4）2SO4 1.0 g/L、CaCO3 4 g/L，pH 6.5的优化发酵培养基条件下，那西肽产量最高为1 582.73 μg/mL。与未优化发酵培养基相比，提高了16.65%。[结论]该研究为今后那西肽的大规模发酵生产提供了基础数据。

关键词 那西肽;诱变育种;高产菌株

中图分类号 R978.1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）33-0080-03

那西肽（nosiheptide）是一类可以从链霉菌中产生的包含多个噻唑环的硫多肽类抗生素，属于具有很强抗菌活性的硫链丝菌类抗生素[1]。链霉菌通过合成抗生素基因分析并表达自身抗性[2]。那西肽是一类非吸收型环保饲料添加剂，具有促进畜禽生长、促进营养吸收、增重增产、没有交叉耐药性、提高饲料利用率，且在动物体内低毒无残留，对环境污染小等优点[3]。那西肽具有促进肝细胞生长、抑制乙肝病毒分泌、抗病毒和抗感染特征[4]。那西肽具有临床药物开发前景，但是由于那西肽水溶性差，因此目前不能应用于临床研究[5]。

虽然那西肽具有良好的市场经济效益，但是由于菌种性能限制，产量目前不能满足于大规模的工业生产。高产菌株选育一直都是抗生素生产工作重点，诱变育种是高产菌株选育常用方法之一。通常对链霉菌采用NTG、紫外线及NTG-紫外线的联合进行诱变育种获得高产菌株[6]。笔者对分离获得的游动放线菌孢子进行紫外诱变与化学诱变，筛选得到高产菌株，为那西肽生产提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种。游动放线菌（内蒙古民族大学生命科学学院微生物生物技术实验室保存）。

1.1.2 培养基。

1.1.2.1 基本培养液。NaCl 0.5 g/L、KNO3 1 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、FeSO4 0.01 g/L、可溶性淀粉20 g/L、MgSO4 0.244 g/L，pH 7.3，121 ℃高温灭菌20 min。

1.1.2.2 种子培养基。葡萄糖 30 g/L、玉米浆 20 g/L、黄豆粉 20 g/L、CaCO3 5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、（NH4）2SO4 3.0 g/L，pH 6.5，115 ℃高温灭菌25 min。

1.1.2.3 发酵培养基。黄豆粉 35 g/L、淀粉 70 g/L、淀粉酶0.3 g/L、豆油 0.4 mL/L、（NH4）2SO4 1.5 g/L、CaCO3 5 g/L，pH 6.5，115 ℃高温灭菌25 min。

1.1.2.4 优化发酵培养基。黄豆粉40 g/L、淀粉70 g/L、淀粉酶0.4 g/L、豆油0.3 mL/L、（NH4）2SO4 1.0 g/L、CaCO3 4 g/L，pH 6.5，115 ℃高温灭菌25 min。

1.2 方法

1.2.1 制备孢子悬液。低温保存的放线菌活化后，取生长好的孢子，3 500 r/min，离心15 min，用pH 7.2的磷酸缓冲液洗涤并分散孢子。孢子液用4层无菌擦镜纸过滤，镜检，获得单孢子悬液。

1.2.2 绘制那西肽标准曲线。准确称量那西肽标准品5 mg，0.1 mL DMF（N，N二甲基甲酰胺）溶解，加入硼酸缓冲液制成1 mg/mL标准液。取不同体积的标准液用硼酸缓冲液、磷酸缓冲液和正丁醇稀释，得到不同浓度的那西肽溶液，37 ℃水浴15 min。取1.5 mL上层液体与1.5 mL无水乙醇摇匀，在波长408 nm处测定各浓度的吸光度。以吸光度值为纵坐标，那西肽浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 化学诱变。单孢子悬液1 mL，各加入1 mL磷酸缓冲液，300 μL 0.2 μg/mL的EMS（甲基磺酸乙酯）溶液，设置诱变时间为10、20、30、40、50、60 min，诱变结束后，取100 μL 0.02 mg/mL NaS2O3洗涤后离心，重复洗涤1次，用于菌种筛选，以原始孢子为对照。

1.2.4 紫外诱变。单孢子悬液1 mL，进行紫外诱变，设置诱变时间为1、2、3、4 min，诱变后用于菌种筛选，以原始孢子为对照。

1.2.5 菌种筛选。将诱变后的孢子液移入基本培养液，28 ℃、200 r/min，振荡培养10 h，无菌擦镜纸过滤，除去菌丝获得孢子液，镜检。取诱变后孢子液稀释至10-3，涂布于高氏1号培养基，28 ℃培养7 d，观察菌落。

挑取单菌落接种于种子培养基，28 ℃、270 r/min，振蕩培养48 h，以接种量5%移入发酵培养基，振荡培养40 h，在波长408 nm处测发酵液中那西肽含量。

1.2.6 那西肽产量的影响因素筛选。对影响发酵培养基的以下因素进行筛选，即酸碱度、豆粉、淀粉、CaCO3、（NH4）2SO4、淀粉酶，调整各因素含量进行发酵并测定那西肽含量，筛选出最佳成分含量[7-8]。

1.2.7 最佳发酵培养基确定。挑取zLL菌落接种于种子培养基，28 ℃、270 r/min振荡培养48 h，以接种量5%移入“1.2.6”筛选的优化发酵培养基中培养40 h，测发酵液中那西肽含量。

2 结果与分析

2.1 那西肽标准曲线

由图1中方程y=1.806 7x+0.030 0（R2=0.998 6）可知，那西肽浓度与吸光值呈良好的线性关系，可作为那西肽含量测定标准。

2.2 化学诱变

由图2可知，诱变40 min时那西肽含量最高，达903.73 μg/mL，与对照相比（那西肽含量为882.81 μg/mL）提高了2.37%。

2.3 紫外诱变

由图3可知，诱变2 min时那西肽含量最高，达1 356.82 μg/mL，与对照相比（那西肽含量为882.81 μg/mL）提高了53.69%，获得1株高产那西肽菌株zLL。

2.4 发酵的影响因素

由图4～9可知，设置不同酸碱度时，那西肽含量不同，在pH 6.5时，那西肽产量最高，为1 486.53 μg/mL;豆粉含量为40 g/L时，那西肽产量最高，为1 484.59 μg/mL;淀粉含量为70 g/L时，那西肽产量最高，为1 471.83 μg/mL;CaCO3含量为4 g/L时，那西肽产量最高，为1 461.83 μg/mL;（NH4）2SO4含量为1.0 g/L时，那西肽产量最高，为1 414.87 μg/mL;淀粉酶含量为0.4 g/L时，那西肽产量最高，为1 417.36 μg/mL。

2.5 最佳发酵培养基确定

在豆粉40 g/L、淀粉酶0.4 g/L、淀粉70 g/L、（NH4）2SO4 1.0 g/L、CaCO3 4 g/L，pH 6.5的条件下，发酵液中那西肽含量1 582.73 μg/mL，与对照那西肽含量（1 356.82 μg/mL）相比提高了16.65%。

3 结论

对保存的游动放线菌进行化学诱变与物理诱变，对诱变菌株发酵那西肽产量进行对比，结果筛选出1株高产菌株，在紫外诱变2 min时那西肽含量达1 356.82 μg/mL，与出发菌株相比（那西肽含量为882.81 μg/mL）提高了53.69%;对发酵培养基进行优化，在豆粉40 g/L、淀粉70 g/L、淀粉酶0.4 g/L、（NH4）2SO4 1.0 g/L、CaCO3 4 g/L，pH 6.5的条件下，那西肽产量为1 582.73 μg/mL，与未优化发酵培养基（那西肽含量为1 356.82 μg/mL）相比提高了16.65%。

参考文献

[1] 莫秋燕，宋元达.过表达根瘤血红蛋白基因对活跃链霉菌那西肽产量的影响[J].安徽农业科学，2016，44（24）：157-159，162.

[2] 李德才.活跃链霉菌产那西肽发酵过程优化控制[D].芜湖：安徽工程大学，2015.

[3] 张秀英，陆连寿，温芳，等.国家那西肽标准品的研制与建立[J].中国兽药杂志，2014，48（12）：50-53.

[4] 张小朋，曹春华，朱游子，等.那西肽的发展状况及其发酵工艺研究进展[J].饲料工业，2014，35（22）：59-62.

[5] 于丽娜，韩宁宁，徐嫄，等.那西肽预混剂质量分析[J].中国抗生素杂志，2016，41（10）：767-770.

[6] 高自召.链霉素抗性突变选育那西肽高產菌株[J].中国兽药杂志，2012，46（8）：43-46.

[7] 赵世光，华骏，杨帆，等.活跃链霉菌合成那西肽的pH分段控制策略[J].中国抗生素杂志，2015，40（11）：818-822.

[8] 周扬，薛正莲，秦艳飞，等.24孔板培养活跃链霉菌合成那西肽条件的优化[J].中国抗生素杂志，2015，40（5）：344-349.