杂交水稻稻曲病原真菌的分离与鉴定

左山 张沫雨 刘雯滍 黎妮 王伟平

摘要 [目的]分离获得与鉴定引发杂交水稻稻曲病的病原真菌。[方法]通过微生物培养方法及多相分类鉴定技术，对引发杂交水稻稻曲病害的病原真菌进行分离与鉴定。[结果]该研究分离获得了引发稻曲病病害的绝对优势病原菌种，并鉴定为稻绿核菌（Ustilaginoidea virens）。[结论]该研究为进一步防治水稻稻曲病病原真菌与减少稻曲病病害发生奠定了科学基础。

关键词 杂交水稻；稻曲病；病原真菌；稻绿核菌

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）13-0108-03

Separation and Identification of Pathogenic Fungus of False Smut in Rice from Hybrid Rice

ZUO Shan1，ZHANG Moyu1，LIU Wenzhi1 et al

（1.Beijing Guangqumen High School，Beijing 100062；2.State Key Laboratory of Hybrid Rice （Hunan Hybrid Rice Research Center），Changsha，Hunan 410125）

Abstract [Objective] To isolate and identify the pathogenic fungi that would cause hybrid rice false smut.[Method]To isolate and identify the pathogen strains of false smut from hybrid rice by the methods of microorganism cultivation and polyphasic taxonomic technology. [Result] In this study，the absolutely dominant pathogenic bacteria that caused the disease of rice smut was isolated and identified as Ustilaginoidea virens.[Conclusion] This study laid a scientific foundation for further prevention and control on rice fungal pathogens and reduction of rice smut disease occurrence.

Key words Hybrid rice；False smut in rice；Pathogenic fungi；Ustilaginoidea virens

水稻稻曲病（Rice false smut）廣泛分布在美洲、非洲和亚洲等地区，其中在我国发生突出。在我国南方稻区，由于夏秋阴雨天气频发，中晚稻生产稻曲病发生较重，对水稻产量和品质均造成了较大损失。稻曲病主要由病原真菌侵染水稻稻穗，形成大于谷粒数倍的菌丝球即稻曲球，且表面覆盖大量的黄色或墨绿色的厚垣孢子，稻曲球不但严重威胁水稻产量和质量，而且能产生对人和牲畜有剧毒作用的真菌毒素，因此进行稻曲病的防治尤为重要[1-7]。

目前稻曲病的防治主要依赖于化学药品，其对环境污染较为严重，生物防治方法有待进一步开发研究。笔者从杂交水稻稻曲病发生地采集了大量的稻曲球，对稻曲病原菌进行分离和鉴定，并进行菌种保藏，以期为生防菌剂的开发奠定微生物生态学基础。

1 材料与方法

1.1 材料 杂交水稻稻曲病发病种子（稻曲球）由湖南杂交水稻研究中心提供，品种为“深两优5814”，于2016年9月采集，地理坐标为112°73′36″E、25°73′08″N。将采集样品置于4 ℃保存。

1.2 培养基及试剂

玫瑰红钠和PDA成品培养基购自北京陆桥公司；基因组DNA快速提取试剂盒购自美国OMEGA公司；PCR相关试剂购自TIANGEN公司；PCR引物由上海生工合成。

1.3 稻曲病病原真菌的分离培养与形态学观察

选取10颗发病种子，用无菌镊子和刀片刮取种子表面的发病组织于无菌水中，然后依次用无菌水稀释成浓度为10-1、10-2、10-3的组织悬液。分别取100 μL悬液涂布于玫瑰红钠平板上（平板含有25 mg/mL氯霉素和25 mg/mL四环素），每个处理3个平行。将玫瑰红钠平板置于25 ℃培养箱培养，从第2天开始对平板上的单菌落进行分离计数，共7 d，根据菌落形态（包括大小、形状、颜色、质地、有无渗透液，有无可溶性色素等）对可培养真菌进行初筛，利用PDA培养基平板纯化菌株。将纯化好的菌株用试管保藏备份。

1.4 病原真菌的分子生物学鉴定

利用基因组DNA提取试剂盒提取真菌基因组DNA，采用通用引物LR0R （5′-GTACCCGCTGAACTTAAGC -3′）和LR5 （5′-ATCCTGAGGGAAACTTC -3′）扩增菌株26S rDNA 序列[8]。PCR 反应体系：模板10×PCR buffer 5 μL、dNTP （2.5 mmol/L） 4 μL、模板 2 μL、Taq DNA 聚合酶 1 μL、引物各 1 μL，补充去离子水至50 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，53 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，33个循环；72 ℃ 7 min。PCR 产物用1%凝胶电泳进行检测并送交上海生工生物工程有限公司测序，PCR 产物用1%凝胶电泳进行检测并送交上海生工生物工程有限公司测序，将测序序列提交至GenBank。

将序列在NCBI核酸数据库中进行Blast比对，选取相近种的模式菌株序列作为内群，选取1个与待测菌株同科不同属的模式菌株序列作为外群，利用ClustalX （1.83）软件进行序列比对分析，采用MEGA5.0软件，邻接法（NJ）构建系统发育树，Kimura 2-parameter模型计算进化距离，进行1 000次的相似度重复计算检验[9]。

2 结果与分析

2.1 分离培养结果

3个稀释度共得到约1×103个菌落，形态学初筛大部分菌落形态特征完全相同，为绝对优势种，判定该优势种为稻曲病主要病原菌，随机挑取6个优势菌菌落进行分纯，并保藏于PDA试管斜面中，原始编号分别为RSF1～RSF6。

2.2 形态学特征

2.2.1 菌落形态。PDA培养基上，25 ℃培养7 d，菌落直径12～14 mm，白色，表面平坦，质地丝绒状，反面黄色，无渗出液產生，无可溶性色素产生；PDA培养基上，25 ℃培养14 d，菌落直径25～27 mm，菌丝白色，中央浅黄色，反面蛋黄色，无渗出液产生，无可溶性色素产生（图2A～D）。

2.2.2 显微形态。菌丝缠绕分枝，透明无色，壁平滑，有横隔，宽度为2.5～3.0 μm；大量菌丝顶端弯曲成菌环；菌丝老后，壁加厚，棕色；生殖菌丝变粗，顶部产生分枝，分隔明显，缢缩断裂产生厚壁膨大的柱状孢子（图2E～L）。

2.3 序列系统发育分析

将上述分离得到的6个纯菌株分别提取基因组DNA，对其26S rDNA序列进行测序与系统发育分析，6个菌株聚为同一系统发育支，且与稻绿核菌（Ustilaginoidea virens）序列相似性均为100%，证明6个菌株为同一菌种，详见系统发育树（图3）。选取菌株RSF6为代表，将该菌株测序序列提交至GenBank数据库，序列登录号为KX885488。

3 讨论与结论

目前，我国杂交水稻育种水平较高，但仍存在一些问题，如部分品种抗性（抗病虫、抗逆）弱，适应生态环境能力不强，一些超级杂交稻品种在推广中因抗性差，导致农业生产减产，造成巨大损失[8]；从另外一个方面来看，对重点病原菌的研究可为制定和实施合理有效的预防措施提供科学的参考依据。

该研究通过微生物培养分离方法，从杂交水稻“深两优5814”稻曲球中分离得到病原真菌，结合形态学比对和核酸序列系统发育分析方法，获得绝对优势病原菌种，并将其鉴定为稻绿核菌，为进一步防治该病原真菌与减少水稻稻曲病病害发生奠定了前期研究基础。

基于该研究进展，下一步将利用多组学研究技术开展该病原真菌致病机理与生防拮抗研究，并从种子微生态学和“植物与微生物共生体育种” [9]的新视角开展杂交水稻的抗稻曲病育种与提质研究，这对于推进杂交水稻种子科学研究及种业发展具有重要的理论与实践价值。

参考文献

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[2] 王洪凯，林福呈.稻曲病研究进展[J].浙江农业学报，2008，20（5）：385-390.

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[4] 黄珊.水稻稻曲病研究进展[J].福建农业学报，2012，27（4）：452-456.

[5] 张俊喜，成晓松，宋益民，等.中国水稻稻曲病研究进展[J].江苏农业学报，2016，32（1）：234-240.

[6] 伏荣桃，王剑，卢代华，等.国内外水稻稻曲病研究进展[J].中国农学通报，2016（12）：189-194.

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[8] 石萌萌.“两优0293”水稻风波[J].科技导报，2015（8）：9.

[9] 王志伟，纪燕玲，陈永敢.植物内生菌研究及其科学意义[J].微生物学通报，2015，42（2）：349-363.