高效除臭菌的分离筛选及Biolog鉴定

窦建军 徐芯渝

摘要 [目的]对高效除臭菌进行分离筛选及Biolog鉴定。[方法]以养猪场的猪粪便和生物滴滤器中的生物膜为样本，经过分离纯化，得到3株具有除臭作用的菌株，命名为DR、DJ、DS，分别对DR、DJ和DS进行16S rRNA和26S rRNA菌種鉴定和Biolog鉴定。[结果]DR、DJ和DS在48 h可以使臭源的恶臭强度从4.0级降低至2.5级左右。经16S rRNA菌种鉴定，DR、DJ和DS分别为副干酪乳杆菌、啤酒酵母菌和梭形杆菌，均为革兰氏阳性菌；在Biolog鉴定试验中，DR、DJ和DS不仅能够代谢20多种糖类及其衍生物，产生乙醇、乳酸、醋酸等物质，而且还能够代谢10多种氨基酸及其衍生物，尤其是腐胺这种低嗅阈值的恶臭物质。[结论] DR、DJ和DS是高效除臭菌，对于有机质恶臭污染的控制有一定的作用。

关键词 除臭菌；分离筛选；16S rRNA；26S rRNA；Biolog

中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）32-0066-05

Isolation and Screening of Highefficiency Deodorizing Bacteria and Identification of Biolog

DOU Jianjun1，XU Xinyu2

（1.Chongqing Mulian Environmental Protection Engineering Co.，Ltd.， Chongqing 400000；2.Faculty of Urban Construction and Environment Engineering， Chongqing University， Chongqing 400045）

Abstract [Objective] The aim was to isolate and screen highefficiency deodorant bacteria and perform Biolog identification.[Method] Using the pig manure from the pig farm and the biofilm in the biological drip filter as samples， three strains with deodorization were obtained by separation and purification， named DR， DJ， DS， 16S rRNA and 26S rRNA species identification and Biolog identification were performed on DR， DJ and DS， respectively.[Result]DR， DJ and DS can reduce the malodor intensity of the stinky source from 4.0 to 2.5 at 48 h.According to 16S rRNA strain identification， DR， DJ and DS were respectively Lactobacillis paracasei， Saccharomyces cerevisiae and Lysinibacillis sphaericus， which were Grampositive bacteria；in the Biolog identification test， DR， DJ and DS could not only metabolize more than 20 kinds of sugars and their derivatives， but also produced ethanol， lactic acid， acetic acid， etc.， and also metabolized more than 10 amino acids and their derivatives， especially the odorous substance of the low odor threshold of putrescine.[Conclusion]DR， DJ and DS are highefficiency deodorizing bacteria， which have a certain effect on the control of organic odor pollution.

Key words Deodorizing bacteria；Isolation and screening；16S rRNA；26S rRNA；Biolog

作者简介 窦建军（1982—），男，山西寿阳人，高级工程师，博士，从事环境微生物及微生物生态研究。*通讯作者，硕士研究生，研究方向：水污染控制。

收稿日期 2018-07-04；修回日期 2018-07-12

恶臭污染属于大气污染，是由于刺激嗅觉器官而引起的心理不愉快，严重时会影响生活环境。由于恶臭污染是以人的嗅觉感知为判断标准，因此区别于其他类型的污染。已知的恶臭气体中，易对生命造成伤害的有几十种，危害较大的如二甲基二硫、三甲胺、硫酚类化合物、硫醇类化合物甲胺、和苯乙烯等，而最常见的就是氨气和硫化氢[1]。

目前国内外已发现的除臭菌包括赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaeficus）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、异常威克汉姆酵母（ Wickerhamomyces anomalus）、植物乳酸菌（Lactobacillus plantatum）、嗜热链球菌（Streptococcusthermo philus）等[2-4]。笔者从养猪场的猪粪便和生物滴滤器中的生物膜中取样，经过分离纯化，得到3株具有除臭作用的菌株，命名为DR、DJ、DS，通过对菌株的培养及脱硫脱氮性能的研究，并经过16S rRNA和26S rRNA的菌种鉴定，为其将来运用于垃圾场、养殖场及污水处理场提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种。

养猪场中新鲜及经过堆肥和腐熟的猪粪便，运行良好的生物滴滤器中生物膜。

1.1.2 仪器。

电热恒温培养箱- HPX-9272MBE（上海博讯公司）；QYC-200小型恒温摇床（上海福玛公司）；数显控温水浴锅-GKC112（上海浦东新区电理仪器厂）；TProfessional 196全自动 PCR扩增仪（德国Biometra公司）；DYY-6C型琼脂糖凝胶电泳仪（北京市六一仪器厂）；凝胶成像系统（UVP）（BioSpectrum AC+Gel Camera 美国UVP公司）；BA200显微镜（MOTIC，麦克奥迪）；Biolog微生物自动鉴定仪- MicrogStation（美国BIOLOG公司）；LXJ-IIB型低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）；高速离心机-HC-2518（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；Starter 3100 pH计（奥豪斯仪器（上海）有限公司）；生化培养箱- SPX智能型（上海予腾生物科技有限公司）；电热恒温培养箱-JC303（上海成顺仪器仪表有限公司）；752紫外可见分光光度计（上海右一仪器有限公司）。

1.1.3 试剂。氯化钠、硫酸镁等均为国产分析纯，蛋白胨、牛肉膏等为生物试剂。

1.2 方法

1.2.1 培养基。

1.2.1.1 菌種富集培养基。

牛肉膏蛋白胨培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化钠5 g、水1 000 mL，pH 7.2，121 ℃灭菌20 min。

1.2.1.2 菌种筛选培养基。

（1）除臭菌株筛选培养基。孟加拉红培养基3.5%、酵母膏0.1%、蛋白胨1.5%、葡萄糖1.0%、琼脂1.8%、pH 6.0，121 ℃灭菌 20 min，葡萄糖单独进行灭菌。

（2）除氮菌株筛选培养基。蛋白胨1.0%、牛肉粉0.5%、酵母粉0.5%、葡萄糖2.0%、吐温80 0.1%、磷酸氢二钾02%、乙酸钠0.5%、柠檬酸三钠0.2%、硫酸镁0.02%、硫酸锰0.005%、碳酸钙1.0%，pH 6.3～6.8，121 ℃灭菌 20 min。

（3）除氮菌株筛选培养基。大豆胨0.5%、蛋白胨0.025%、酪蛋白胨0.03%、酵母浸粉0.3%、牛肉粉0.5%、乳糖0.6%、抗坏血酸0.05%、β-甘油磷酸钠2%、硫酸镁0.025%、琼脂2%、pH 7.0～7.4，121 ℃灭菌 20 min。

（4）除硫菌株筛选培养基。氯化铵0.2%、磷酸氢二钾0.05%、氯化镁0.02%、碳酸氢钠0.5%、氯化钠0.5%、九水硫化钠0.06%、柠檬酸钠1.5%，pH 7.2，121 ℃灭菌 20 min。

1.2.2 菌种的分离和纯化。

将养猪场的粪便以采集的生物膜分别置于锥形瓶中，加入100 mL纯水进行稀释，取20 mL加入200 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基当中，分为两组进行培养，A组在35 ℃、120 r/min的摇床中恒温培养，B组放置于35 ℃恒温厌氧缸中静置进行厌氧培养，富集10 d。

将两组发酵液进行梯度稀释，用平板涂布法接种在筛选培养基平板上，放置在35 ℃培养箱中，A组直接进行培养，B组继续进行厌氧培养，挑取平板上长出的单菌落用划线法反复进行纯化，直到得到单一的菌株。

将筛选到的菌株进行液体培养，培养2～3 d以后将培养液喷洒在粪便上，间隔6 h用嗅辨法测定粪便的恶臭强度。臭味强度指人们通过嗅觉感觉到的气味的强弱程度，0级为无气味；1级为能稍微感觉出极微弱的臭味；2级为能勉强辨别出臭味的品质；3级可明显感觉到有臭味；4级为较强的气味；5级为让人无法忍受的强烈臭味。当臭味强度超过3级时，即可认为大气已受到恶臭污染。具体方法为：由3名嗅辨员测定恶臭强度，取其平均值。选择具有除臭效果的菌株用甘油保种方法，置于4 ℃的冰箱中进行菌种保藏[5]。

1.2.3 菌种的形态特征观察。

1.2.3.1 菌落形态观察。

观察平板中固体培养基上的菌落，描述其大小、颜色、形状等。

1.2.3.2 革兰氏染色观察。

用接种环挑取待测固体培养基上经过筛选后纯化的菌落，在滴过纯水的载玻片上涂匀成薄膜状，使载玻片通过酒精灯火焰，加热并将细菌固定。

然后对其进行革兰氏染色：

①加草酸铵结晶紫1滴，约1 min，水轻轻冲洗；

②媒染：滴加卢戈氏碘液冲去残水，并覆盖约1 min，水轻轻冲洗；

③用95%乙醇滴洗涂片，直至流出乙醇不出现紫色为止，脱色约20 s，立即用水冲净乙醇；

④用番红染液复染1 min，水轻轻冲洗。

在光学显微镜下对染色后的菌体形态100倍放大进行观察记录。

1.2.4 菌种的rRNA序列分析。

在PCR管中添加4 μL无菌超纯水，然后用无菌的枪头挑取单菌落在其中洗脱作为PCR模板，上下引物均选取细菌通用引物，①上游引物（27F）：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物（1492R）：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′；②上游引物（F341）：5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′和下游引物（R518）：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′；③上游引物（NL1）：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′，下游引物（LS2）：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′[6-7]。

建立PCR的反应体系50 μL：模板 4 μL、Master Mix 25 μL、27F（10 μmol/L）2 μL、1492R（10 μmol/L）2 μL，ddH2O补足至 50 μL。反应条件：95 ℃预反应5 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，反应循环35次；72 ℃延伸10 min；18 ℃保温60 min。

反应完成，用琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物纯度以及大小：预先制备的1%的琼脂糖凝胶，内含核酸染料，PCR反应完成后，取4 μL的PCR扩增产物点样于琼脂糖凝胶点样孔中，在1×TAE的电泳液中进行电泳，电压100 V。使用凝胶成像系统，在紫外灯下观察，检测合格后，-20 ℃冰箱保存备用。

将PCR产物委托金瑞斯生物科技有限公司进行测序，并将测序结果中Blast板块与Genbank数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov）中已有细菌的16S rRNA 序列进行相似性比对。

1.3 菌种的Biolog鉴定分析

Biolog系统说明如表1所示[8]。Biolog 技术的操作顺序如表2所示。根据之前的rRNA序列分析，判断菌种类型，试验程序按 Biolog公司的操作指南，菌株DR使用Biolog GENⅢ Plate，DJ和DS使用Biolog EcoPlate进行，所有菌株在Biolog推荐的培养基（ BUG + B）上在30 ℃ 恒温培养箱中培养36 h[9]。用木制接种棒挑取外半部分的单菌落，在试管内壁旋转几圈，将菌落转移至试管内壁，将其接种在GN/GP-IF接种液中，进行搅动，使菌落分散均匀，制成悬浊液。

2 结果与分析

2.1 菌种的分离和纯化

从养猪场粪便以及生物膜中分离得到3株具有除臭作用的菌株，命名为DR、DJ和DS，其中，DR分离自生物膜中，在厌氧环境下生长；菌株DS和DJ来自猪粪，DJ在厌氧环境下生长，DS则能同时在有氧和缺氧条件下生长。菌株DR、DJ和DS对恶臭强度的缓解能力见表3。从表3可以看出，所得到的3株菌株对恶臭均有着较好的控制能力，在48 h内，恶臭强度能从4级降至2.2～2.5级。

2.2 菌种的形态特征

DR、DJ和DS对应的菌落形态以及经过革兰氏染色后的显微镜观察结果如图1和表4所示。

2.3 菌种的rRNA序列分析

对DR、DJ和DS的PCR扩增产物用电泳凝胶成像系统进行检查，如图2所示，DS和DJ在1 500 bp处的明亮条带，DR在500 bp处的明亮条带，其扩增结果良好，符合微生物rRNA测序的要求。

2.4 生长曲线的测定及pH变化

根据测得的OD600的吸光度和pH，以时间（h）为横坐标，绘制了菌株DR的生长曲线，并描述了在生长过程中DR的pH变化（图3）。

菌株DR在初始12 h处于生长延缓期，生长速率较缓慢；12～22 h进入对数生长期，22～32 h为其生长稳定期，在培养过程中pH不断下降至3.56，在厌氧培养过程中，在厌氧呼吸的作用下产生大量乳酸改变了培养液的pH。

菌株DJ的生长较迅速，在经历了4 h的生长延缓期后就迅速进入了对数生长期，10 h后进入生长稳定期；在培养过程中pH在5～7浮动，略有增加的趋势；DJ的生长曲线符合一般细菌的生长规律；菌株DJ的稳定期较长，便于批量培养。

菌株DS的生长较快，生长延缓期只有短暂的2 h，紧接着就开始了对数生长期直到14 h，14～22 h为生长稳定期；在培养过程中pH在9.35上下浮动，先下降后升高；由于菌株DS的衰亡非常缓慢，便于批量培养，因此选取培养48 h的培养物进行后续试验。

2.5 菌种的Biolog鉴定分析

3株除臭菌株在Biolog ECO和GENIII鉴定板上的显色反应如图4所示。以A1孔为对照，定义为阴性反应，记录GenIII鉴定板1～9列共71种碳源，分析它们的利用情况。从显色反应的结果来看，与A1孔类似的反应标记为“阴性”反应（-），看起来偏紫色（深于A1）的标记为“阳性”反应（+）。有时，Biolog的平板总微孔中的色反应不明显的则标记为中性（＼）。以GenIII鉴定板的A10孔为对照，10～12列所檢测的是化学敏感性，孔内吸光值不到A10孔的一半，定为“阴性”反应（-），孔内吸光值超过A10孔一半的反应被定为“阳性”反应（+）。

从图4可看出，3株细菌的阳性反应均很明显，对鉴定板中碳源的利用情况不完全相同（显色反应上存在一些差异）。

Biolog Eco鉴定板含有31种不同的碳源，每一种碳源重复3组。通过分析菌株对几种典型的碳源底物在不同生长阶段的代谢情况，来描述各菌株之间对于不同碳源的利用差异。鉴定板中的碳源底物根据其官能团和代谢途径的不同可分为6类：糖类及其衍生物、羧酸、氨基酸、多聚物、酚酸类和胺类。Biolog Eco鉴定板反应一般采用每孔颜色平均变化率（AWCD）[8]来描述，表征微生物利用碳源的整体能力以及微生物的代谢活性。

菌株DR的碳源利用情况如图5，在培养初始阶段，利用率最高的是D-海藻糖和D-果糖，且DR对于这2种碳源的高利用效率始终持续到碳源消耗殆尽。初始阶段对于L-乳酸和α-羟基-丁酸也有利用，但是略低于D-海藻糖和D-果糖，可见以上4种碳源都是DR最容易利用的碳源，同时消耗速度也非常快。在24 h时，肌苷、甘油和N-乙酰神经氨酸也能得到利用，其中肌苷的利用能力最好，相对维持的时间也更长。最滞后的是乙酸，在48 h后才开始得到充分利用。

利用能力最高的9种碳源底物中，4种是糖类，4种是羧酸，1种是脂类[11]。最终的消耗结果分别为甘油>乙酸>肌苷>N-乙酰神经氨酸>α-羟基-丁酸>蜜二糖>D-果糖>L-乳酸>D-海藻糖。

除此之外，菌株DR对包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖、水杨苷、龙胆二糖等在内的10种糖类都有一定的利用能力，在代谢过程中产生乙醇、乳酸、醋酸等产物，同时，对组胺、N-乙酰-D-半乳糖胺等多种氨基酸及其衍生物有降解作用，也说明菌株DR对氨基酸类物质的利用能力远不及糖类物质。

菌株DJ的碳源利用情况如图6，事实上DJ对多种碳源都能很好的利用，因此在碳源消耗上较均匀持久，在此仅选取了其中最为显著的一部分。菌株DJ的适应期较长，在24 h 后出现明显的变色反应，其中最容易被利用的I-赤藻糖醇，其利用效率缓慢稳定持久，一直持续到中后期；48 h时，D-纤维二糖的利用效率明显提升，且稳定增长，持续代谢；在72 h时，L-天冬酰胺酸的吸光度增长率迅速升高。D-苹果酸直到84 h才开始进行剧烈的代谢反应。而D-葡萄胺酸在DJ生长的整个过程都是持续稳定的碳源，其吸光度稳定增长。菌株DJ作为一种酵母菌它还能将腐胺（丁二胺）这种嗅阈值极低的恶臭物质进行代谢。

6种碳源底物[12]中，2种属于糖类及其衍生物，3种是羧酸，1种属于氨基酸底物及其衍生物，最终的AWCD值分别为L-天冬酰胺酸>D-葡萄胺酸>D-苹果酸>I-赤藻糖醇>D-纤维二糖>N-乙酰-D-葡糖胺。

3 结论

从臭源猪粪便等筛选获得了能够高效去除氨气和硫化氢等恶臭物质的3种菌株DR、DJ和DS，对其进行形态观察、分子生物学鉴定以及生长曲线测定，3种菌种分别为副干酪乳杆菌（Lactobacillis paracasei sp.）、酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）和梭形杆菌（Lysinibacillis sphaericus）。经过Biolog的

鉴定分析，DR、DJ、DS不仅对20多种糖类及其衍生物类型的碳源具有良好的利用能力，并在培养过程中产生乙醇、乳酸、醋酸等物质，而且对10多种氨基酸及其衍生物类型的碳源有良好的代谢能力，尤其是腐胺这种低嗅阈值的恶臭物质，这对于有机质恶臭污染的控制有一定作用。

基于已经得到的高效除臭菌株，可以通过物理、化学等多种诱变方法使其基因突变，得到更加高效、广谱的菌株，获得更高降解效率，并深入研究除臭菌株的大罐发酵的技术；寻找菌株之间的最佳组合和最佳除臭效率，以期能更好地应用于实际的工业化生产中。

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