不同山楂叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性研究

申笑菡　宋小锋　左燕华　任伊佳　路灯云

[摘 要]为研究资源丰富的药源植物山楂叶提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性，用滤纸片法测定三种不同山楂叶提取物对金黄色葡萄球菌的体外抑菌作用，以无菌水为阴性对照，以万古霉素（30μg）为阳性对照。用2倍稀释法测定其最低抑菌浓度（MIC）。结果显示：剂量相同的山楂叶提取物对供试菌的抑菌效果由强到弱依次排列为：山楂叶乙醇纯化提取物>山楂叶乙醇粗提物>山楂叶水粗提物。5mg的山楂叶乙醇纯化提取物与30?g的万古霉素相比对金黄色葡萄球菌的抑菌作用十分相近。山楂叶提取物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.625mg/mL。

[关键词]山楂叶；金黄色葡萄球菌；体外抑菌作用；最低抑菌浓度

[中图分类号]S816.73 [文献标识码]A

山楂叶是蔷薇科植物山里红（Grataegus pinnatifida Bge.vanr.major N.E.Br.）或山楂（Grataegus pinnatifida Bge.）的干燥叶，夏、秋二季采收，晾干。具有活血化瘀、理气舒络、化浊降脂的功效。山楂叶在我们的生活中极其常见，目前对其研究报道主要集中于有效成分的提取及总黄酮活性研究上。金黄色葡萄球菌听上去很美，其实是个“美丽杀手”，在全球由金黄色葡萄球菌引起的感染仅次于大肠杆菌。现阶段对金黄色葡萄球菌的耐药性与金黄色葡萄球菌引起的免疫反应研究较为成熟。本实验初步探究不同山楂叶提取物对金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的体外抑菌功效作用，为该药食同源品种的深入研究提供数据参考和实验支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

金黄色葡萄球菌ATCC 25923（生命科学技术学院保存）；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC 43300（郑州安图生物工程有限公司惠赠）；万古霉素细菌药敏纸片（杭州滨河微生物试剂有限公司）；山楂叶水粗提物含20%总黄酮（生命科学院自制：山楂叶→水提→过滤→浓缩→干燥）；山楂叶乙醇粗提物含30%总黄酮（生命科学院自制：山楂叶→醇提→过滤→浓缩→干燥）；山楂叶乙醇纯化提取物含90%总黄酮（生命科学院自制：山楂叶→醇提→过滤→浓缩→大孔树脂纯化→干燥）；MH培养基（杭州天和微生物试剂有限公司）；营养琼脂培养基（杭州天和微生物试剂有限公司）；无水乙醇；生理盐水等均为分析纯试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的活化及菌悬液的制备

按无菌操作法，将斜面保存的金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌接种在相应的营养琼脂培养基上复苏（37℃条件下培养24 h），用无菌生理盐水配制成与0.5麦氏比浊管浊度相同的浓度为1.5×108CFU/mL的菌悬液。

1.2.2 山楂叶提取物纸片制备

用打孔器打出内孔直径为6mm的滤纸片后高压灭菌，无菌条件下取100mg/mL的山楂叶提取物溶液50μL滴加滤纸片上并晾干。

1.2.3 不同山楂叶提取物抑菌功效研究

将活化后所制的菌悬液均匀涂布于MH培养基，利用滤纸片法测定山楂叶提取物的抑菌效果，每平皿贴5张滤纸片，山楂叶水粗提物纸片、山楂叶乙醇粗提物纸片、山楂叶乙醇纯化提取物纸片，无菌水纸片作为阴性对照，万古霉素纸片作为阳性对照。放入37℃恒温培养箱培养24h，每组实验三个重复。

1.2.4 山楂叶提取物最低抑菌浓度（MIC）的测定

根据CLSI（美国临床和实验室标准协会，2016），使用2倍稀释法确定山楂叶提取物最低抑菌浓度。用2倍稀释法将质量浓度100mg/mL的山楂叶乙醇纯化提取液稀释至100～0.781mg/mL，8个浓度梯度，吸取各个浓度梯度的山楂叶总黄酮溶液2mL，与约18mL的无菌培养基（小于45℃）充分混匀，冷却制成含样液的平板，并进行编号，吸取金黄色葡萄球菌菌悬液50μL采用涂布法涂平板。同时以20mL不含山楂叶提取物的MH培养基作为阴性生长对照，吸取金黄色葡萄球菌菌悬液50μL均匀涂布于平板。37℃恒温培养箱培养24h，观察接种平板有无菌落生长，细菌不生长的最高稀释度为该山楂叶提取物的MIC。

2 结果与分析

2.1 山楂叶提取物对S.aureus金葡和MRSA的抑菌作用

实验结果通过抑菌圈直径的大小表现山楂叶提取物的抑菌强度。由表1可得：剂量相同的山楂叶提取物对供试菌的抑菌效果由强到弱依次排列为：山楂叶乙醇纯化提取物>山楂叶乙醇粗提物>山楂叶水粗提物。随着山楂叶提取物总黄酮含量的增多相应抑菌活性也有所升高。由表1及图1、图2可以看出5mg的山楂叶乙醇纯化提取物与30μg的万古霉素抑菌作用相当。但山楂叶水粗提物，山楂叶乙醇粗提物与万古霉素相比抑菌强度显著较弱。由此可知，山楂叶乙醇纯化提取物对金黄色葡萄球菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有较好的抑菌效果。

2.2 山楂叶提取物MIC测定

根据表1的抑菌实验结果，选择对供试菌抑制效果明显的山楂叶乙醇纯化提取物作为供试样液进行MIC测定。由表2可知，在浓度为0.313mg/mL的MH培养基上培养能生长出金黄色葡萄球菌单菌落，而在含浓度为0.625mg/mL及以上时培养无菌落出现，故可知山楂叶提取物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.625mg/mL。

3 结论

依据山楂叶提取物的生物活性，可将其投入到医药、化妆品和功能性食品的应用中，也可以提高产品附加值和进一步推广山楂叶提取物新产品的应用。加速推动山楂叶的资源化利用，打破长期以来出口山楂叶原料或粗提物的局面，变废为宝。本实验采用纸片扩散法对金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌进行体外抑菌实验，以抑菌圈直径作为评价指标，探索山楂叶提取物对供试菌种的抑菌效果。结果表明，金黄色葡萄球菌对山楂叶提取物较为敏感，5mg的山楂叶乙醇纯化提取物与30μg的万古霉素抑菌作用相当。山楂叶提取物对金黄色葡萄球菌的MIC值为0.625mg/mL。将山楂叶提取物作为生物活性原料时，既可以起到相應的降压、降血脂、软化血管、增加冠状动脉流量等药理作用，又可兼具抑菌的作用。现阶段由于抗生素的滥用，耐药菌株不断增加，出现逐年上升的趋势，中药抑菌成分较多，可作用于细菌的不同部位和繁殖的不同阶段，使病原微生物不易产生耐药性，因此，中医药预防和治疗感染性疾病近年来受到越来越多的关注，从天然植物中提取抗菌成分开发新型抗菌药会成为一个研究热点，有很好的发展前景。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2] 弓威，顾丰颖，贺凡，等.山楂叶有效成分提取工艺优化及抗氧化活性研究[J].农科学报，2015（08）.

[3] 许瑞波，赵跃强，鲁升丽，等.山楂叶黄酮的超声提取、精制及抗氧化性研究[J].食品研究与开发，2007（04）.

[4] 殷慧霞.认识金黄色葡萄球菌降低感染风险[J].大众标准化，2014（11）.

[5] 甘晓玲，李剑平，郑韵芳.微生物学检验实验指导[M].北京：人民卫生出版社.2010.