黔东南甜藤植物水溶性总黄酮提取及含量动态研究

杨秀全　王绍云　周江菊

[摘 要]研究黔东南甜藤水溶性总黄酮最佳提取工艺、含量测定及动态变化规律，为其作为保健食材资源的开发利用提供理论依据。以水为溶剂，在一定水浴温度下，超声提取甜藤中总黄酮，用分光光度法测定水溶性总黄酮的含量。通过单因素试验，再正交试验优化甜藤中水溶性黄酮最佳提取条件。甜藤中水溶性总黄酮的最佳提取工艺条件为：液料比为25 ： 1，浸泡时间为110 min，超声时间为60 min，水浴温度为45 ℃，此条件下甜藤水溶性总黄酮得率为0.71%。黔东南不同地方的甜藤中水溶性总黄酮含量有较大的差别，以日照较长的南部榕江县的含量最高。不同季节甜藤茎中水溶性总黄酮的含量不同，12月采集的甜藤茎总黄酮含量最高。甜藤不同器官中黃酮类化合物的积累也不同，叶>果>茎。

[关键词]黔东南；甜藤；总黄酮；含量测定；采收期

[中图分类号]Q946 [文献标识码]A

甜藤Paederia Scandens （Lour） Meer为茜草科鸡屎藤属草本植物，别名甜藤（贵州黔东南）、鸡屎藤、牛皮冻、狗屁藤，香藤，国内外均有分布，在我国主要分布于长江流域及其南部地区，是传统的中药材。临床上主要用于治疗风湿疼痛、胃肠疾病、肮腹疼痛、肾病、降脂降血糖、白血病及其他疑难杂症，近年研究发现甜藤水提取液具有较强的抑菌作用，用于治疗消化系统疾病疗效独特。甜藤的主要有效成分有环烯醚萜类、黄酮类、糖、多糖、氨基酸、抗坏血酸及其甙类、挥发油等多种天然产物，具有抗氧化、抗菌、消炎、抗肿瘤、保肾、镇痛、降脂、降尿酸等药理作用。甜藤不仅药用，还是许多地区传统特色美食的料理材料，贵州黔东南的 “甜藤粑”“侗果”，广东的“鸡藤煲老鸭”，海南的“鸡屎香粑”等特色美食。贵州黔东南传统特色食品甜藤粑和侗果制作的主要原料之一是甜藤茎的水提取液。

而大量文献证实植物黄酮类化合物具有广泛的生物活性，具有抗氧化作用，抗菌、消炎、抗癌、调整免疫系统和内分泌等多种医疗保健功能，已经应用到保健品、药品、食品和化妆品等领域。

对于甜藤的研究主要集中在化学成分和临床应用，而有关甜藤植物中黄酮类化合物的研究鲜见报道。黔东南产甜藤中黄酮类化合物的研究尚未见报道。通过参考相关文献，探究黔东南甜藤水溶性黄酮类化合物最佳提取工艺、含量测定及动态变化进行研究，为进一步深层次发掘黔东南甜藤植物在保健食材资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：甜藤（茎、叶及果）样品，2016年1月——2016年12月采于黔东南地区。将其洗净，沥干水分，置于50 ℃下干燥箱中干燥至恒重，粉碎，过40目筛，为试验用甜藤样品原料。

对照品芦丁（99.0%，中国生物制品检验所）；乙醇、亚硝酸钠、氯化铝、氢氧化钠，均为分析纯；试验用水均为蒸馏水。

1.2 仪器

UV-2550 紫外-可见分光光度计（日本岛津公司），SK2510LHC型超声波公司清洗器（上海科导超声仪器有限），AR2140型电子分析天平（奥斯国际贸易（上海）有限公司），ZK-82A型真空干燥箱（上海市实验仪器厂），TD5M型低速离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司），WK-1000A小型高速粉碎机（青州市精诚医药装备制造有限公司），其它玻璃仪器。

1.3 试验方法

1.3.1 芦丁对照品溶液的制备

准确称取20.0 mg芦丁对照品于小烧杯中用30%乙醇溶解，定量转移至50 mL棕色量瓶中，定容，摇匀，配制成0.4 mg/ mL的芦丁标准液，避光保存，备用。

1.3.2 供试品溶液的制备

取甜藤茎（或叶）粉末约3 g，称准至0.001 g，按照液料比为25： 1（提取溶剂为蒸馏水），置于250 mL锥形瓶中，用保鲜膜盖住瓶口，称量并记下质量，浸泡110 min，在超声频率59 kHz、功率100 W、水浴温度为45 ℃下超声提取60 min，取出，冷却至室温，再补重，将其转移到离心管，离心10 min（4000 r/ min），过滤，取续滤液，静置，避光保存，待测。

1.3.3 以水为提取溶剂，甜藤中总黄酮提取工艺优化

取同一批次甜藤茎粉末约3 g，每份准确至0.001 g，于250 mL锥形瓶中，按一定的液料比加入蒸馏水，混匀，盖上保鲜膜，称量，固定超声频率59 kHz和功率100 W下进行超声提取甜藤中水溶性黄酮类化合物。分别考察液料比、浸泡时间、超声提取时间、超声水浴温度对黄酮类化合物提取效果的影响。在单因素试验基础上，再进行正交试验，优化以水为溶剂超声提取总黄酮的最佳工艺。

1.3.4 方法学考察

1.3.4.1 检测波长的确定。用移液管精密量取芦丁对照品溶液、供试品溶液各适量，分别置于25 mL容量瓶中，按1.3.4.2项下方法操作显色后，在400 nm～600 nm波长范围内扫描，以确定检测波长。

1.3.4.2 标准曲线及线性范围试验。精密量取芦丁对照品溶液（浓度为0.4 mg/ mL），0.00 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL、3.00 mL于25 mL容量瓶，分别向其加入30%乙醇溶液至10 mL，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，静置10 min，再加入10%氯化铝溶液0.3 mL，摇匀，静置10 min，再加入5%氢氧化钠溶液4.0 mL，加入蒸馏水至刻度线，摇匀，静置15 min。以0.00号作空白对照，于波长515 nm处测吸光度，以芦丁对照品溶液质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4.3 精密度试验。取2.00 mL芦丁对照品溶液（质量浓度为0.4 mg/ mL）于25 mL容量瓶中，按1.3.4.2项操作显色后，于515 nm处重复测定6次，测定吸光度值，计算吸光度值的相对标准偏差（RSD值）。

1.3.4.4 稳定性试验。黄酮易被氧化，稳定性试验为了确保实验误差在允许的范围。分别取甜藤叶、茎粉末约3 g，准确称定至0.001g，按1.3.2项方法制备供试品溶液，用锡箔纸包裹装有提取液的试剂瓶，避光保存于温度为4 ℃冰箱中，分别在0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 、24.0 h下，每次量取供试品溶液3.00 mL置25 mL的容量瓶中，按1.3.4.2项方法操作显色后于515 nm处测吸光度值，计算吸光度值的RSD。

1.3.4.5 重复性试验。取同一批样品叶、茎粉末各3份，每份约3 g，按1.3.2项方法制备供试溶，取一定量供试溶按1.3.4.2项方法操作显色后于515 nm处测吸光度值，用外标法计算样品中总黄酮含量。

1.3.4.6 加样回收率试验。取甜藤茎（或叶）样品约3g，准确称定至0.001g，按1.3.2项制备提取液，取9支25 mL容量瓶，编号（1、2、3、4、5、6、7、8、9），向9支容量瓶中分别加入1.00 mL提取液，再向1、2、3号容量瓶中加入1.00 mL0.4 mg/ mL芦丁对照品溶液，向4、5、6号容量瓶加入2.00 mL0.4 mg/ mL芦丁对照品溶液，向7、8、9号容量瓶加入3.00 mL0.4 mg/ mL芦丁对照品溶液，按1.3.4.2项下方法操作，于515 nm处测定吸光度值，计算回收率。

1.3.5 样品中水溶性总黄酮含量的测定

取甜藤样品约3g，准确称定至0.001g，按1.3.2项制备提取液，按1.3.4.2项下方法操作，于515 nm处测定吸光度值，用外标法计算样品中总黄酮的含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 探究液料比对甜藤水溶性总黄酮提取效果的影响

室温下浸泡30 min后，在水浴温度为35 ℃，超声提取时间40 min条件下，考察液料比对水溶性黄酮类化合物提取效果的影响，结果见如图1，结果表明，液料比为20时黄酮得率最高，故选择15、20、25三个水平进行正交试验。

2.1.2 探究浸泡时间对甜藤水溶性总黄酮提取效果的影响

按液料比为20，室温下浸泡一定时间后，在水浴温度为35 ℃，超声提取时间40 min条件下，考察浸泡时间对水溶性黄酮类化合物提取效果的影响，结果见图2，结果表明，浸泡时间60 min后黄酮得率趋于平缓，选择以60min、90min、110min三个水平进行正交试验。

2.1.3 探究超声时间对甜藤水溶性总黄酮提取效果的影响

按液料比为20，室温下浸泡30 min后，在水浴温度为35 ℃条件下，超声提取一定时间，考察超声时间对水溶性黄酮类化合物提取效果的影响，结果见图3，超声时间为80 min时黄酮得率最高，随着超声时间的延长，黄酮得率反而略有降低，可能因为超声时间较长局部温度过高，导致稳定性较差的黄酮成分被破坏。选择60 min、80 min、100 min三个水平做正交试验。

2.1.4 探究超声水浴温度对甜藤水溶性总黄酮提取效果的影响

按液料比为20，室温下浸泡30 min后，在一定水浴温度下，超声提取40 min，考察超声水浴温度对水溶性黄酮类化合物提取效果的影响，结果见图4，从图可见，水浴温度为55 ℃时黄酮得率最高，随着水浴温度的升高，黄酮得率逐渐下降，说明有些黄酮成分高温时稳定性降低。选择以45 ℃、55 ℃、65 ℃三个水平进行正交试验。

2.2 正交试验

通过以上单因素试验对甜藤水溶性总黄酮提取效果探究上，以液料比（A）、浸泡时间（B）、超声时间（C）、水浴温度（D）设计正交试验，设计因素如表1，正交试验结果如表2。

由表2，根据试验结果并进行极差分析，四个因素对甜藤水溶性黄酮提取效果影响依次为：水浴温度（D）> 液料比>（A）浸泡时间（B）> 超声时间（C）。通过正交试验直观的分析，提取甜藤总黄酮最佳条件为A3B3C1D1，即为液料比为25 ： 1、浸泡时间为110 min、超声时间为60 min、水浴温度为45 ℃。

2.3 方法学考察结果

2.3.1 检测波长的确定。结果对照品芦丁溶液经显色后在515 nm处有最大吸收，供试品溶液经显色后在515 nm处也有较强的吸收，故确定515 nm为测定波长，以提高测定结果的灵敏度。

2.3.2 标準曲线及线性范围试验。以吸光度值（A）对芦丁对照品质量浓度（C）的进行线性回归，其方程为A = 10.057 C+0.0026，r=0.9997， 说明芦丁对照品溶液质量浓度在0.016～0.048 mg /mL范围内与吸光值具有良好的线性关系。

2.3.3 精密度试验。测得吸光度值的RSD为0.5%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验。分别测得吸光度值的RSD为2.6%（叶）、1.9%（茎），表明叶和茎的提取溶液在24 h内稳定。

2.3.5 重复性试验。以黎平产甜藤为供试品（9月份采），测得甜藤叶、茎中水溶性总黄酮得率分别为2.23%、0.22%；RSD分别为2.8%、1.5%。表明方法的重现性较好。

2.3.6 加样回收率试验。用甜藤叶加样回收率试验，结果见表4，结果的RSD = 3.26%。用同样方法，测得甜藤茎样品加样回收试验，结果的RSD = 2.17%，表明测定方法的准确度比较高。

2.4 样品含量的测定

2.4.1 黔东南不同地方甜藤茎中水溶性总黄酮的含量

2016年2月采甜藤茎样品，按前述方法处理样品、提取及测定，结果见表4。

由表4结果可知，同季节不同产地的甜藤茎中水溶性总黄酮的含量差异较大，从江甜藤茎中水溶性总黄酮的含量最高为0.71%。

2.4.2 不同采收期甜藤茎样品的总黄酮含量变化

采集黎平产地不同采收期（每月中旬采集）的甜藤茎，按前述方法处理样品、提取及测定，结果见图5。

由图5可知，在一年的生长期中，甜藤茎中水溶性总黄酮含量在12月初～1月中旬达到最高为0.79 %，含量最高，从1 ～ 7月持续下降，最低值为0.11 %；又从8～12月持续上升。其中，2 ～ 5月和6 ～ 9月的黄酮含量差异不大，趋势图平缓。通过试验得出，以水溶性黄酮含量为标准，甜藤茎最佳采收期应为12月至1月。

2.4.3 甜藤不同部位的水溶性总黄酮含量比较

取同一产地同采收期（9月份）不同部位的甜藤样品，按前述方法处理样品、提取及测定，结果见表5。

3 结论与讨论

（1）以水为提取溶剂，超声提取甜藤茎中水溶性总黄酮的最佳条件是：液料比为25 ： 1、浸泡时间为110 min、超声时间为60 min、水浴温度为45 ℃。此条件下测得黔东南部分地区（主要是侗族地区）野生甜藤中水溶性总黄酮得率，结果显示，不同地方含量不同，以从江、榕江及黎平的含量较高。黄酮类化合物受环境因素影响较大，光照条件是主要因素，受光越充足，黄酮含量越高，从江、榕江及黎平位于黔东南的南部年均日照时较其他地方要长。

（2）不同季节甜藤中水溶性总黄酮的含量不同，12月采集的甜藤茎黄酮的含量最高。分析其原因主要是：一方面，甜藤是一种蔓性草质藤本植物，生长初茎部色绿柔软，可以进行光合作用和次生代谢，从而参与植株到代谢过程，形成的次生代谢产物较多，故此时茎部的黄酮含量较高，但随着植株的生长，逐渐木质化，不再或很少参与到植株的代谢过程，因此从1月份开始至9月时，其含量也随着逐渐降低，同时全株为满足生长的需要，形成的初生代谢产物主要提供给其营养生长，初生代谢产物转化为次生代谢产物（如黄酮）的量相对较少，故6月～9月是黄酮含量的低谷期；到了秋冬季节，各组织发育成熟，植株生长缓慢，光合作用、呼吸作用变弱，次生代谢物很少或没有发生转移或降解，却累积在茎部组织中，故使黄酮含量逐渐升高，另一方面，黄酮在植物中的积累还受光照时长、温度等影响较大，夏季光照最强，黄酮合成逐渐积累，从9月～12月甜藤中的黄酮含量明显持续上升，从而形成12月黄酮含量的高峰期。

（3）甜藤叶、果、茎中水溶性总黄酮含量差别较大，叶>果>茎。从实验结果分析，这与各部位的光合作用强度有关，叶受光充足且光合作用强，与文献研究结论一致。

[参考文献]

[1] 傅立国，陈潭清，朗楷永，等.中国高等植物[M].青岛出版社，2004.

[2] 徐金龍，刘雷，秦路平.鸡屎藤的化学成分、药理活性及临床应用研究进展[J].药学实践杂志，2011（06）.

[3] 吴强，郁建生，崔恒敏.雏鸡肠炎沙门氏菌病的苗医辩证及鸡矢藤防治作用[J].江苏农业科学，2013（06）.

[4] 张梅，康晓慧，马林.五种药用植物提取液抑菌作用研究[J].湖北农业科学，2011（04）.

[5] 陈伟明，梁军，黄志，等.鸡屎藤与鱼鳅和抗生素联合抑菌试验研究[J].安徽农业科学，2012（05）.

[6] 毛彩艳，袁之琼，林丽佳.云南鸡矢藤根、茎、叶水提取物的体外抗菌研究[J].大理学院学报，2013（03）.

[7] 毛彩艳，申元英.云南鸡屎藤研究现状及临床应用[J].中国民族民间医药，2013（03）.

[8] 胡海青，韩贺东，林燕，等.广西鸡屎藤的化学成分研究[J].中国中药杂志，2013（16）.

[9] 李洋，郑承剑，秦路平.毛鸡屎藤全草的化学成分研究[J].中草药，2012（04）.

[10] 刘晓燕，李彬.绵阳鸡矢藤中总黄酮的提取及含量测定[J].安徽农业科学，2015（22）.

[11] 贤景阳，赖秋河，陈明真.鸡矢藤总黄酮的提取及其抗氧化性分析[J].南方农业学报，2013（12）.

[12] 刘金福，李晓雁，孟蕊.苦荞发芽过程中促进黄酮合成的因素初探[J].食品工业科技，2006（10）.

[13] 沈晓琴，徐照辉.不同药用部位及不同采收期疏花荠苧总黄酮含量动态比较[J].中国药师，2014（4）.

[14] 吕品.国内植物化感作用及其在农业和环境保护中的应用研究[J].安徽农业通报，2009（15）.

[15] 李燕，王春兰，郭顺星，等.植物组织和细胞培养物中黄酮类化合物质积累影响因素的研究进展[J].中国药学杂志，2006（09）.