硒在猪营养和繁殖中的作用

唐彩琰 陈建康

上期回顾：上期主要介绍了硒与动物繁殖力之间的关系、哺乳动物精液的脂肪酸组成以及精液的脂质过氧化反应。

中图分类号：S816.72 文献标志码：C 文章编号：1001-0769（2018）08-0058-04

4 公猪精液的抗氧化系统

在进化过程中，生物体会形成众多特殊的抗氧化保护机制来应对活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）的作用。因此，正是有了这些天然抗氧化剂才使生物体能在富氧的环境中存活（Halliwell，1994）。这些机制被统称为“抗氧化系统”。抗氧化系统种类多样，主要负责保护细胞免受自由基的作用。Surai（2006）将这些系统概括为：

● 天然的脂溶性抗氧化剂（如维生素E、类胡萝卜素、泛醌等）；

● 水溶性抗氧化剂（如抗坏血酸、尿酸、牛磺酸等）；

● 抗氧化酶：超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）和过氧化氢酶（Catalase，CAT）；

● 由谷胱甘肽系统（谷胱甘肽、谷胱甘肽还原酶、谷氧还蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶）和硫氧还蛋白系统（硫氧还蛋白、硫氧还蛋白过氧化物酶、硫氧还蛋白还原酶）组成的硫醇氧化还原系统。

保护性抗氧化剂化合物位于细胞器、亚细胞组分或细胞外，为细胞提供最大程度的保护作用。因此，活细胞的抗氧化系统包括3个重要的防御水平（Surai，2002，2006）。

第一级防御通过消除自由基的前体物或通过失活催化剂来防止自由基的形成，它由3种抗氧化酶即SOD、GSH-Px和CAT+金属结合蛋白组成。由于超氧自由基是在细胞正常生理条件下产生的重要自由基（Halliwell，1994），因此，SOD（EC 1.15.1.1）被认为是细胞第一级抗氧化防御的主要成分。

目前，研究人员在哺乳动物中鉴定出了3种不同的SOD亚型，并给出了它们的基因组结构、cDNA序列和蛋白质结构（Zelko等，2002）。应该注意的是，SOD1或铜（Cu）–SOD/锌（Zn）-SOD是该家族首个被描述特征的酶，它是一种含有Cu和Zn的同源二聚体，几乎只存在于细胞质中。SOD1以32 kDa同源二聚体形式存在，存在于每一种被检测细胞的细胞质和细胞核中（Zelko等，2002）。该家族的第2个成员（SOD2）需要锰（Mn）作为辅因子，因此也被称为Mn-SOD。研究表明，SOD2是一种96 kDa的同源四聚体，只存在于线粒体基质中，而这里是超氧自由基生成的主要部位（Halliwell和Gutteridge，1999）。Mn-SOD是一种诱导型酶，其活性受细胞因子和氧化应激的影响。1982年，Marklund和其同事发现了第3种SOD同工酶，由于其只位于细胞外而被称为细胞外超氧化物歧化酶（Extracellular Superoxide Dismutase，EC-SOD）。EC-SOD是一种分子量为135 000 kDa的糖蛋白，对肝素具有很高的亲和力。EC-SOD的表达模式高度受限于特定的细胞类型和组织，其活性可能超过Cu-SOD、Zu-SOD或Mn-SOD。

超氧化物歧化酶按如下反应将超氧自由基歧化：

式中，SOD为超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）。

由SOD反应形成的过氧化氢可以被GSH-Px或CAT消除，并按如下反应模式还原为水：

式中，GSH-Px为谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase）；Catalase为过氧化氢酶。

过渡金属离子还可加速脂质过氧化物分解成细胞毒性产物，如醛类、烷氧基自由基和氢过氧自由基：

式中，LO*为脂质自由基（Lipid free radical），LOO*为脂质过氧化自由基（Lipid peroxyl radical），LOOH为脂质过氧化物（Lipid hydroperoxide）。

因此，金属结合蛋白（转铁蛋白、乳铁蛋白、结合珠蛋白、血液结合素、金属硫蛋白、血浆铜蓝蛋白、铁蛋白、白蛋白、肌红蛋白等）也属于第一级防御系统。

不幸的是，细胞的第一级抗氧化防御不足以完全阻止自由基的形成，一些自由基从第一级抗氧化系统的预防性安全筛选中逃逸出来，从而引发脂质过氧化作用并对DNA和蛋白质造成损伤。第二级防御系统由断链抗氧化剂（维生素E、泛醌、类胡萝卜素、维生素A、抗坏血酸、尿酸）和其他抗氧化剂组成。谷胱甘肽和硫氧还蛋白系统在第二级抗氧化防御中也有重要作用。断链抗氧化剂将链增长反应中的链长度保持在尽可能小的程度来抑制过氧化作用。因此，Surai（2002）认为，断链抗氧化剂是通过清除链反应中的过氧化自由基中间体来防止脂质过氧化的增长过程：

式中，LOO*为脂质过氧化自由基（Lipid peroxyl radical），Toc为生育酚（Tocopherol）；Toc*为生育酚自由基（Tocopherol radical）；LOOH为脂质过氧化物（Lipid hydroperoxide）。上述反应中形成的过氧化氢可由GSH-Px清除。

然而，实际上细胞中的第二级抗氧化防御也不能阻止ROS和活性氮對脂质、蛋白质和DNA的破坏。在这种情况下，第三级防御是以可以消除或修复受损分子的系统为基础。这一级抗氧化防御包括脂肪分解（脂肪酶）、蛋白水解[肽酶或蛋白酶（内肽酶，Protease）]和其他酶[DNA修复酶、连接酶、核酸酶、聚合酶、蛋白酶（外肽酶，Proteinase）、磷脂酶和多种转移酶]。

公猪精液的第一级抗氧化防御是由SOD、CAT和GSH-Px组成的（Strzezek等，1999；Kowalowka等，2008；Koziorowska-Gilun等，2011）。最初，从用冷冻公猪精液制备的上清液经纯化和定性后得到的SOD对氰化物敏感，其分子量为31 000，结构中含有Cu和Zn。

事实上，Kowalowka等（2008）对从公猪精浆中得到的细胞外分泌型SOD（EC-SOD）进行了纯化同质。SOD的分子性质和特异性证实，这种纯化的酶是公猪精浆中的细胞外Cu/Zn-SOD。从公猪精浆和精子中分离得到的SOD的抗原决定簇彼此相似（Orzolek等，2013）。公猪精浆中还含有CAT和谷胱甘肽（Koziorowska- Gilun等，2011）。然而，公猪精液中CAT的含量似乎相当低，尤其是与血液中的CAT浓度相比时。CAT在哺乳动物精液抗氧化防御中的保护作用值得怀疑（主要是在H2O2浓度远高于生理水平时发挥功能）（Vernet等，2004）。

我们应该注意，在精子形成过程，含有CAT的过氧化物酶体会从生殖细胞中清除掉（Nenicu等，2007）。猪精液中有关抗氧化酶的数据是可变的。例如，在公猪精子中可以检测到SOD活性，但检测不到GSH-Px活性（Cerolini等，2001）。相反，这两种酶的活性在精浆中都可以检测到。SOD活性在不同公猪精子中差异很大，精子和精浆中每毫克蛋白质的活性范围分别为167.7 IU～926.6 IU和3.32 IU～13.8 IU （Cerolini等，2001）。

生殖道分泌的抗氧化剂能够保护精子在射精后免受ROS的毒性作用。Koziorowska-Gilun等（2011）证明，清除精浆的氧化能力依赖于公猪生殖道中各种液体所含的不同抗氧化剂的作用。他们还指出，精子在附睾尾部表现出较高的SOD活性和相對较低的PH-GSH-Px活性。附睾尾部精子中GSH-Px活性、谷胱甘肽还原酶活性和谷胱甘肽-S-转移酶活性可以忽略不计，而CAT的活性检测不到。附睾尾部和前列腺液中SOD的活性更高。此外，前列腺液似乎是精浆中CAT活性的主要来源，而附睾尾部液体中GSH-Px的活性最高（Koziorowska-Gilun等，2011）。

精子和精浆中CAT的浓度很低，因此谷胱甘肽和GSH-Px是清除已生成的过氧化氢的主要成分（Surai，2006）。小鼠精子中的GSH水平相对较高，而猪精子仅含痕量的GSH（Luberda，2005）。此外，公猪精子中的GSH-Px活性以及谷胱甘肽还原酶的活性都很低或无法检测到（Li，1975）。然而，公猪精浆含有极高水平的GSH （Strzezek等，1999；Strzezek，2002）。

据推测，公猪精子难以抵抗诱导型ROS的毒性作用（Strzezek等，2005），因为精浆中SOD水平相当低且缺乏GSH-Px。该作者认为，L-谷胱甘肽、L-麦角硫因和L-维生素C是负责精浆抗氧化功能的主要化合物。然而，公猪精浆仅含有中等浓度的抗坏血酸（Audet等，2004）。有趣的是，Audet等（2004）未能在公猪精浆中测到维生素E；且公猪精子中的维生素E浓度比血浆维生素E水平低10%（Audet等，2009）。然而，由于处理过程中精细胞产生的ROS增多，在人工繁育行业，保护精细胞免受氧化损伤特别重要（Bathgate，2011）。

向公猪精液中添加抗氧化剂可提高精子质量的观察结果间接证明了ROS对精子功能具有破坏作用。Cerolini等（2000）的研究证明公猪精子的活性在储存过程中逐渐降低，而当向稀释剂中添加维生素E后可显著抑制这种趋势。特别是添加维生素E可显著降低过氧化作用（精子产生的硫代巴比妥酸）。储存在处理稀释剂中的精子随着培养基中维生素E含量的降低会快速地富集α-生育酚。在精子储存期间，向稀释液中加入α-生育酚能显著有效地防止发生对照组精子磷脂中22：6n3水平显著降低的那种情况。精液冷冻保存会增加ROS的产生，导致精子膜受损（Buhr等，1994；Chatterjee等，2001）。向解冻培养基中添加GSH可减少获能的活精子数；随着膜蛋白中巯基的变化，精子数量减少；ROS产生减少；染色质浓缩较低；卵母细胞体外渗透能力增强；精子头解凝比例升高（Gadea等，2005）。与对照相比，在添加亚硒酸钠（Sodium Selenite，SS）、硒代蛋氨酸（Selenomethionine，SeMet）和维生素E（分别为5.5 μg/L和1.0 mM）的稀释液中，公猪精子的运动性、活力和顶体反应均显著增强（Tareq等，2012）。此外，在含有300 μM氨的稀释液中，用SeMet和SeMet + 维生素E处理精子也能导致相同精液质量参数的显著增加。显然，有必要进一步阐明公猪精液抗氧化防御系统的组成和功效。

尽管通常来说ROS过量产生对精子有害，但越来越多的证据表明低水平的ROS会参与控制哺乳动物精子的一系列生理功能（Surai，2006）。因此，各种试图在公猪精液储存过程中通过向稀释剂中添加各种抗氧化剂来减少精液中脂质和蛋白质氧化作用的尝试都应该非常小心，因为ROS可以通过多种信号传导途径（如细胞外信号调节激酶途径）调节公猪精子的获能，该途径可以根据蛋白质的分子量对其进行不同的磷酸化（Awada等，2009；Awda和Buhr，2010）。事实上，这些作者证明，暴露于ROS产生系统以及随后在获能培养液中孵育时的公猪精子，其顶体反应的百分比随时间的推移显著增加。通常来说，低水平的ROS可诱导精子超活化、获能、精子-卵细胞融合和顶体丢失，而高浓度的ROS可抑制精子-卵细胞融合，降低精子的运动性，并会损害精子的DNA（Surai，2006）。

通过营养手段提高精子的抗氧化能力可以为提高雄性动物繁殖能力提供重要的机会。有效防止脂质过氧化作用的有益结果可能是由两种相关的机制引起的（Surai，2006）。首先，抗过氧化损伤的防御措施对于防止精子磷脂功能上重要的C20-22 PUFA水平下降以及维持精子结构的完整性至关重要。其次，尽可能减少脂质过氧化作用可防止过氧化作用的有毒产物的积累。对于在精液冷冻保存期间使用抗氧化剂来改善精子活力我们还可以设想存在其他可能性。

考虑到含硒蛋白在细胞氧化还原稳态中的重要作用以及在应对各种应激时含硒蛋白表达增加（Surai，2006），很明显，精液的抗氧化防御和公猪最佳硒营养的重要性想要高估也困难。

（待续）

原题名：Selenium in pig nutrition and reproduction： boars and semen quality - a review（英文）

原作者：Peter F. Surai（匈牙利）和Vladimir I. Fisinin（俄罗斯）