云南复烤烟叶不同地点醇化过程中可培养真菌种群分析

吴光丽 孙玮宏 董高峰 王毅 宋鹏飞 马永凯 魏云林 季秀玲 李海燕

摘要：为较全面的了解云南复烤烟叶在不同地点醇化过程中真菌多样性，挖掘其中的有益微生物，提高烟草醇化品质，以复烤烟叶为试验材料，利用18S rDNA克隆测序技术，系统研究了其醇化过程中可培养真菌的种群结构。结果表明，醇化过程中，复烤烟叶叶面真菌数量除曲靖仓库在6月有所上升外，其余各地均随着醇化的进行而逐渐下降，其中曲靖和楚雄两地非常接近，元江最少；通过形态特征及18S rDNA鉴定，烟叶叶面真菌包括根霉属真菌、青霉属真菌、曲霉属真菌等24个真菌属（种）。不同地点，不同时期烟叶叶面真菌的数量、种类及优势种群不尽相同，而根霉属真菌始终为优势种群。

关键词：复烤烟叶；醇化；真菌：18S rDNA

烟叶是一种经济价值较高的商品，是卷烟工业的主要原料。由于当年复烤的烟叶存在刺激性大、青杂气重、烟气粗糙、余味涩口、香气不够显露等特点，不适宜直接进行卷烟生产，需经过一段时间的醇化来改善烟叶化学成分协调性及评吸质量，从而达到生产标准。在烟叶醇化过程中，微生物及其产生的酶发挥着极其关键的作用微生物不仅可以通过自身的生命活动作用于烟叶醇化过程，还可通过其代谢产生的生物酶参与烟叶的生理生化反应，促进烟叶中生物大分子的转化。有研究表明，将微生物或酶用于烟叶醇化可缩短醇化时间，提高烟叶品质和改善烟气特性。相反，如果醇化过程中某类微生物过度繁殖，则会影响烟叶醇化品质，后续的卷烟生产及质量控制。因此，研究醇化过程中微生物的变化规律，对调控微生物作用，提高醇化效率，乃至揭示烟叶醇化机理具有重要意义。关于烟叶醇化过程中微生物变化已有不少研究，但关于复烤烟叶不同地点醇化其叶面微生物的变化却鲜有报道。

云南是我国烟草原料大省，然而云南立体气候特点明显、不同地区生态条件差异显著，势必影响到微生物群落结构差异，从而对烟叶醇化品质产生重要影响。但目前尚未见关于云南复烤烟叶不同地点醇化过程中叶面可培养真菌群落结构的比较研究。基于此，本研究对置于弥勒、曲靖、元江、楚雄4地的红花大金元复烤烟叶叶面可培养真菌数量、种类及其动态变化规律进行研究，为进一步研究烟叶醇化机理和人工调控烟叶醇化进程提供依据。

1材料与方法

1.1供试材料

本试验所用的烟叶为红云红河集团及红塔集团2014年的红花大金元复烤烟叶，共选取7个样品进行试验，分别为昆明WDB2F及WDC3F、曲靖WDC3F及WBBSF、红河WDC3F及WBBSF、大理VC02S。

1.2醇化地点及气候条件

所有供试红花大金元（简称红大，HD）复烤烟叶样品均分别入库弥勒、曲靖、元江和楚雄4个仓储地。弥勒烟叶仓库的年平均气温19.8℃、湿度为73.3%，曲靖烟叶仓库的年平均气温19.8℃、湿度为58.2%，元江烟叶仓库的年平均气温24.36℃、湿度为65%，楚雄烟叶仓库的年平均气温20.5℃、湿度为59.6%。

1.3取样及真菌分离

于2015年4、10月：2016年1、7、9月于每个醇化地同步采集自然醇化了0、6、9、15和17个月的烟草样品，采用无菌袋（1500 g/袋）密封包装，每地7个样，共140个样品，测定烟叶叶面真菌种类及数量。

在無菌条件下，从每个烟叶样品中随机选取50个烟叶片段，然后用无菌剪刀剪成1cmx1cm大小组织块，并从中随机取30个组织块贴于PDA平板上（10个组织块/平板，平板直径为90mm），28℃恒温培养箱中黑暗培养2～55 d，隔天观察，发现组织块周围有真菌长出，则将其挑取并转接到新鲜PDA平板上，纯化后接于PDA斜面进行分类、鉴定及保藏。

1.4菌株鉴定

1.4.1形态学鉴定根据菌落颜色、形态、生长速率、质地和分泌物状态与颜色等，将分离得到的真菌分为不同的形态类群（morphotype）之后，从各类群中随机挑取3-5株接种于PDA平板上，经过一段时间的培养后，通过对孢子形态结构与大小、产孢方式与产孢结构等特征来确定菌株的分类地位。对于不产孢的菌株，则进行促孢培养，产孢后按上述方法进行鉴定。对于利用各种方法促孢后仍然不产孢的类群，则依据菌落质地、颜色、生长速率，菌丝颜色、粗细和结构等特征划分为不同的无孢类群组（mycelia sterile）。

1.4.2分子鉴定

对于那些不产孢或产孢后仍不能确定其分类地位的菌株，则通过测定其18S rDNA序列，并与Genebank上的序列比对后，再结合其形态特征来确定其分类地位。具体做法为：将供试菌株从斜面转接到PDA平板上进行活化，采用CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵法）提取菌株基因组DNA。随后利用真菌ITS通用引物ITSl（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）进行PCR扩增。扩增产物经纯化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，合格后送硕擎生物科技有限公司进行测序。所得序列与NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的序列进行比对，根据覆盖率和相似度并结合形态学特征确定其分类地位。

2结果

2.1烟叶叶面可培养真菌数量及其动态变化

从弥勒、曲靖、元江、楚雄4个醇化地、5个不同醇化时间点的140个烟叶样品的4200个烟叶片段中，共分离得到1636株真菌，其在醇化过程中各醇化地的分布及变化见图1。由图1可知，烟叶经过一段时间的醇化后，除曲靖和楚雄两地在醇化9个月后烟叶叶面真菌数量非常接近外，各醇化地烟叶叶面真菌数量差异较大，但总体而言，在各个醇化时间点都是元江烟叶叶面的真菌数量低于其他3个醇化地（醇化17个月后略高于弥勒）。且除曲靖醇化烟叶叶面真菌数量在醇化6个月时有所上升外，各醇化地烟叶叶面真菌的数量均随着醇化时间的延长而降低。

2.2烟叶叶面可培养真菌种类及其动态变化

如表1所示，本试验共鉴定出真菌24个属（种），目前仍有4类真菌无法确定其种属，对于形态学难鉴定的菌株，其代表性菌株的分子鉴定结果见表2。由表1可知，在各个醇化时间点，不同醇化地烟叶叶面真菌的种类各不相同。如醇化6个月时，弥勒烟叶叶面有球毛壳菌（Chaetomium globosum）、Cercophora samala、Myrmaecium rubricosum和小不整球壳属真菌（Plectosphaerella spp.），但其他3个醇化地烟叶叶面则无：醇化9个月时，楚雄烟叶叶面有青霉属真菌Penicillium spp.）、Teratosphaeriamolleriana和Coprinops&lagopus，但其他3个醇化地的烟叶叶面则无。

而同一醇化地在各个醇化时间点，其烟叶叶面真菌的种类也不同。如弥勒烟叶醇化6个月时出现小不整球壳属真菌、醇化17个月时出现Coniochaeta velutina。同样，曲靖烟叶醇化9个月时出现小毛克孢属真菌（Chaetomella spp.）、醇化17个月时出现枝孢属真菌（Cladosporium spp.）、球毛壳菌及Chaetomium elatum，而在其他时期却未检测到其存在。

在醇化刚开始时（0个月），各样品中只检测到根霉属真菌及黑附球菌，但随着醇化时间的延长，根霉属真菌的数量不断减少，其他真菌逐渐出现，烟叶叶面真菌种类不断增加。而4个醇化地在相同的醇化时间点，其烟叶叶面真菌的种类数目也不同，具体如下：醇化6个月时，弥勒真菌种类>元江>楚雄>曲靖；醇化9个月时，楚雄>弥勒>曲靖>元江：醇化15个月时，元江>弥勒>楚雄和曲靖（两地一样多）：而醇化17个月时，曲靖>元江>楚雄和弥勒（两地相同），未呈现任何规律性。

2.3不同地点优势菌群及其比例

不同地点优势菌群及其比例见图2。随着醇化时间的延长，各醇化地的优势菌群不断发生变化。如弥勒烟叶醇化0个月及9个月时优势菌只有根霉属真菌，所占比例分别为99.2%、96%，醇化6个月时优势菌有根霉属真菌和Chaetomium属真菌，所占比例分别为87%、6.45%，15个月时有根霉属真菌、枝孢属真菌和Sarocladium属真菌，所占比例分别为74.4%、7%及4.65%，17个月时有根霉属真菌和Coniochaeta velutina，所占比例分别为73.7%、10.52%。同样，元江烟叶醇化0个月、6个月及9个月时优势菌均只有根霉属真菌，所占比例分别为99.2%、93.5%及96%，而醇化1 5个月时有根霉属真菌、青霉属真菌、Cercophora属真菌及枝顶孢霉属真菌（Acremonium spp.），所占比例分别为20.8%、12.5%、12.5%及12.5%，醇化17个月时，有根霉属真菌、青霉属真菌、枝孢属真菌及镰刀菌属真菌（FusaHum spp.），所占比例分别为60.9%，8.7%，8.7%及8.7%。

各醇化地在相同的醇化时间点，其烟叶叶面真菌优势菌群不同，但根霉屬真菌始终是各醇化地、各醇化时间点的绝对优势类群。而青霉属真菌、曲霉属真菌、镰刀菌属真菌、属真菌、Myrmaecium rubricosum和枝孢属真菌在烟叶醇化过程中也十分普遍，但不同醇化地、不同醇化时间点其优势各异。

3讨论

本研究发现云南复烤烟叶（红大）在醇化6个月后，云南楚雄和曲靖两地烟叶叶面真菌数量非常接近，与弥勒和元江存在较大差异。总体而言，元江醇化烟叶叶面真菌数量最少。除曲靖醇化烟叶叶面真菌数量在醇化6个月时有所上升外，各醇化地叶面真菌的数量均随着醇化时间的延长而降低。醇化过程中4地烟叶叶面真菌数量、种类及优势菌群不同，可能与楚雄、弥勒、曲靖、元江4个醇化地的环境差异（年均温、湿度等）有关：曲靖和楚雄年均温湿度比较接近，与弥勒及元江差异较大，弥勒年均湿度最高，高达到73.3%，元江年均温度最高，高达24.4℃。这与以往的报道一致，即醇化烟叶叶面微生物的数量和种类与发酵条件密切相关。而随着醇化的进行，真菌数量不断减少、种类及优势菌群不断发生变化，可能与醇化时间有关。醇化初期烟叶叶面营养物质丰富，叶面残留及环境中的微生物在叶面大量生长，叶面微生物数量较多，随着醇化的进行，烟叶含水量降低，叶面营养物质减少，微生物生长受限，且微生物间存在拮抗作用，相互抑制而使其数量逐渐减少，种类及优势菌群也不断发生变化。杨金奎等也发现醇化烟叶表面可培养微生物的数量随着醇化时间的延长呈明显的下降趋势，而种类也在不断变化。同样，韩锦峰等、段焰青等、赵铭钦等及朱大恒等也发现了同样的现象。

根霉属真菌是本研究中的绝对优势菌群。余玉莎等发现米根霉TZK-1能够发酵烟末增加烟叶致香成分，同时，在烟叶醇化过程中，根霉属真菌也有可能引起烟叶霉变。因此，本研究表明，根霉属真菌在云南弥勒、曲靖、元江、楚雄4个烟叶醇化地的各个醇化时期均为优势菌群之一，其数量及动态变化在云南红大烟叶醇化品质方面应该发挥着极其重要的作用，值得进一步深入研究。

4结论

本研究表明，醇化过程中，不同醇化地烟叶叶面真菌数量均随着醇化时间的延长而不断下降，而真菌种类有所增加。不同醇化地点同一醇化时间及同一醇化地点不同醇化时间，其烟叶叶面真菌数量、种类及优势菌群不同。根霉属真菌在各醇化时期及各醇化地均为优势菌群，前期占比90%以上：随着醇化时间延长，青霉属真菌、枝孢属真菌及Chaetomium属真菌等种类出现且比例有所增加。微生物数量及动态变化在云南红大烟叶醇化品质方面的作用值得进一步深入研究。