利用BSMV Agro/LIC进行小麦条锈菌耐高温相关基因功能分析的互作体系构建

吴艳琴 王金鑫 李雪 高海峰 王凤涛　冯晶　蔺瑞明　徐世昌

（1. 中国农业科学院植物保护研究所， 植物病虫害生物学国家重点实验室， 北京 100193；

2. 新疆农业科学院植物保护研究所， 乌鲁木齐 830091）

摘要

为利用HIGS技术研究条锈菌耐高温胁迫相关基因的功能，需要构建小麦品种与条锈菌及大麦条纹花叶病毒Barley stripe mosaic virus （BSMV）亲和互作体系。本研究选用20个常温下（10℃）高感条锈病的小麦品种和22个耐高温条锈菌菌株，进行高温（21℃）条件下接种亲和性分析，发现11个品种高感条锈病、3个菌株耐高温性稳定且毒性谱较宽。在此基础上，利用含有小麦TaPDS基因片段的重组BSMV侵染上述候选小麦品种，确定‘Local Red等6个品种与BSMV亲和程度符合试验要求。筛选出小麦品种‘Local Red与菌株153352、153234等组成的最佳互作组合，适合利用BSMV Agro/LIC方法开展小麦条锈菌耐高温相关基因功能的研究。

关键词

小麦条锈病； 基因干涉； 大麦条纹花叶病毒； 耐高温性； 互作体系

中图分类号：

S435.121.42， Q933

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017103

Development of an interactive system for functional analysis of

hightemperature tolerancerelated genes of wheat stripe

rust pathogen by using BSMV Agro/LIC

WU Yanqin1， WANG Jinxin1， LI Xue1， GAO Haifeng2，

WANG Fengtao1， FENG Jing1， LIN Ruiming1， XU Shichang1

（1.State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant

Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China； 2. Institute of

Plant Protection，Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091， China）

Abstract

In order to characterize the biological functions of the hightemperature tolerancerelated genes of Puccinia striiformis f.sp. tritici （Pst） by using HIGS method， it is necessary to develop a compatible interactive system containing wheat variety and Pst pathogen and Barley stripe mosaic virus （BSMV）. In this study， 20 varieties （highly susceptible when inoculated at 10℃） were inoculated with 22 hightemperaturetolerant isolates at 21℃ and their compatibility levels were evaluated， and we found 11 highly susceptible varieties among the tested ones and 3 isolates with a highly stable level of hightemperature tolerance and a wider virulence spectrum. Based on the results， 6 varieties such as ‘Local Red were compatible with the BSMV strain containing a TaPDS fragment. Therefore， the combinations of the variety ‘Local Red with the isolates like 153352 and 153234 were the best interactive systems for characterizing high temperaturetolerancerelated genes of Pst with BSMV Agro/LIC.

Key words

wheat stripe rust； gene interference； Barley stripe mosaic virus； hightemperature tolerance； interactive system

条锈病是小麦上重要的气传叶部病害之一，在中国曾发生4次大规模暴发流行，造成小麦严重减产[1]。该病害在其他小麦生产国也造成危害，严重威胁着世界粮食安全供给。一般而言，小麦条锈病属于低温真菌病害，冷凉潮湿的环境条件适宜病原菌夏孢子萌发和侵染[2]。然而近年来在小麦条锈菌越夏区调查发现，条锈菌越夏海拔下限呈逐渐下降趋势，如在云南、川西北和甘肃陇南等地越夏海拔下降50～ 300 m[3]。随着全球气候变暖，在其他国家和地区也出现小麦条锈菌耐受高温胁迫能力增强的现象，如Milus等发现美国2000年后新出现的菌株比2000年以前出现的菌株更适应高温环境且具有更强的侵染力[4]。Hovmller等发现2000年之后出现的2个侵染性更强且适应高温胁迫的条锈菌菌株在不到3年的时间里在北美、澳大利亚以及欧洲范围内快速传播[5]。因此，小麦条锈菌耐高温性是世界性问题，将对病害发生流行、病原菌的毒性变异、寄主抗性调控以及防控策略制定等产生深远影响。然而，由于小麦条锈菌是专性寄生真菌且侵染周期长，目前还缺乏遗传转化的技术途径，急需建立一个条锈菌基因功能分析的技术体系，促进小麦条锈菌与寄主互作過程中基因功能的研究进程。近年来，基于病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）发展起来的寄主诱导的基因沉默（host induced gene silencing，HIGS）技术，利用RNAi基因干涉原理直接针对病原真菌基因，可以通过吸器等特殊结构进入病原菌细胞内沉默目的基因，明确专性寄生真菌的基因功能。Yin等利用大麦条纹花叶病毒Barley stripe mosaic virus（BSMV）介导的HIGS方法，首先实现了针对小麦条锈菌的相关基因的研究[6]。然而，目前适合单子叶植物的病毒载体只有雀麦花叶病毒Brome mosaic virus（BMV）与BSMV，且对小麦宿主的基因沉默效果比较稳定的只有BSMV载体[78]。因而，选用已有的BSMV载体，构建适合研究条锈菌耐高温相关基因功能的技术体系尤为重要。在此技术体系中，不仅要获得耐高温性稳定且毒性较强的条锈菌菌株，还需要筛选获得相应的不具有温敏抗性的高感条锈病品种，同时适合BSMV侵染后产生温和的亲和反应型。另外，选择的小麦品种在苗期至成株期的不同发育阶段在高温条件下都是高感条锈病。

本研究从已获得的22个耐高温菌株中进一步筛选适合于利用HIGS技术研究耐高温相关基因功能研究的菌株；从常温下对所有菌株都表现为高度感病（侵染型4型，严重度100%）的20个品种中筛选出高温条件下以及不同叶龄时期均具有高感病表型的品种。结合BSMV侵染情况，构建利用HIGS技术研究条锈菌耐高温相关基因功能的互作技术体系。

1 材料与方法

1.1 材料

供试条锈菌菌株：选用2013年-2016年鉴定筛选获得的22个来源于不同省份的耐高温小麦条锈菌菌株（表1）。

供试小麦品种：苗期常规接种温度条件（10℃）下高感条锈病（侵染型4型，严重度100%）的20个品种（表2）。

病毒载体：pCaBSα、pCaBSβ、pCaBSγ以及含有小麦TaPDS（编码八氢番茄红素脱氢酶phytoene desaturase）基因片段的重组病毒载体质粒由中国农业大学李大伟教授惠赠，含有小麦条锈菌Tublin（TUB）基因片段的重组病毒载体质粒由本实验室构建。以上质粒均转入农杆菌EHA105，于-80℃条件下长期保存备用。

供试植物材料：无毒本生烟以及供试小麦品种均由本实验室保存。

供试试剂及溶液：“花宝”营养液；石英砂；硅藻土；LB培养基（蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，去离子水定容至1 L并调节pH值为7.0，固体培养基按15 g/L添加琼脂粉）；农杆菌悬浮液（每100 mL灭菌水加入1 mL 1 mol/L MES，1 mL 1 mol/L MgCl2，100 μL 150 mol/L MAS）；硫酸卡那霉素（100 mg/mL）；利福平素（25 mg/mL）；磷酸缓冲液（20 mmol/L，pH 7.0）。

1.2 方法

1.2.1 小麦条锈菌扩繁与耐高温性评价

采用高感病品种‘铭贤169扩繁22个耐高温条锈菌至产生足量的夏孢子，同一批次依次接种20个供试小麦材料。即将待鉴定的小麦材料播种于直径为10 cm的塑料花盆中，待出苗9～10 d，选取第一片叶完全展开且长势一致的幼苗，采用扫抹法接种‘铭贤169扩繁的菌株夏孢子。接种后的小麦材料于（21±0.3）℃黑暗保湿24 h，然后转移至13～16℃的温室（L∥D=16 h∥8 h，光照强度8 000～12 000 lx）继续潜育培养约16 d，调查发病严重度。根据高温条件下条锈菌在高感病品种‘铭贤169上侵染严重度，将条锈菌耐高温性水平分为0、1、2、3、4、5共6级（表3）[9]。

1.2.2 BSMV扩繁

1.2.2.1本生烟的培育

将本生烟草Nicotiana benthamiana种子播种于草炭土与蛭石按照3∶1混合的塑料盆中，待烟草长至两片叶完全展开，移栽至塑料穴盘。育苗间温度22～25℃，湿度70%，光照4 100 lx左右。期間每隔10 d补充一次“花宝”营养液，健康幼苗长至8～10叶期进行去顶，烟龄达30 d可用于病毒接种试验。

1.2.2.2 农杆菌接种健康烟草

将-80℃保存的农杆菌（分别含有BSMV的α、β、γ链，其中γ链携带小麦TaPDS基因片段）在LB固体培养基（含10 mg/mL Kana和50 mg/mL Rif）上划线，28℃培养至有单菌落生成。用灭菌枪头挑选单菌落于3 mL LB液体培养基（含10 mg/mL Kana和50 mg/mL Rif），28℃振荡培养过夜。将过夜培养的单菌落菌液转接至50 mL LB液体培养基（含10 mg/mL Kana和50 mg/mL Rif）继续振荡培养过夜。4℃转速4000 r/min离心10 min收集农杆菌，利用农杆菌悬浮液调节菌液浓度至A600=0.7。将分别含有BSMVα、β、γ链的土壤农杆菌悬浮液等体积混合，28℃黑暗静置3 h以上。用1 mL无菌注射器（去掉针头）注射8～10叶期健康的本生烟草叶片，利用健康烟草为过渡寄主扩繁病毒。每株烟草注射顶端幼嫩的2～3片叶，叶背打孔，全叶注射，黑暗过夜，置于光照周期L∥D=16 h∥8 h，光照强度4 000～5 000 lx，温度22～25℃，湿度75%的光照培养箱培养。

1.2.2.3 BSMV接种小麦

剪取注射后5～7 d的已经感染病毒的烟草叶片并称量重量。灭菌的研钵中加入1∶1（W∶V）的20 mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0），研磨烟草叶片成浆状并用无菌纱布过滤。收集滤液，滤液中加入1%的石英砂与硅藻土。蘸取烟草汁液混合物，自下往上单向摩擦接种小麦。远距离喷水清洗接种小麦叶片，于20℃恒温培养，光照周期L∥D=16 h∥8 h，湿度70%。观察供试材料接种携带小麦TaPDS cDNA片段的BSMV后其症状表现，根据叶片产生的褪绿条纹以及漂白症状明确供试小麦品种对BSMV的亲和程度。BSMV接种设置2次独立生物学重复，每次生物学重复包括2个技术重复。

1.2.3 干涉TUB基因后小麦条锈菌耐高温性分析

当健康的本生烟草长至30 d，分别注射BSMV：00（含有BSMV的α、β、γ链，其中γ链不携带任何外源片段）农杆菌悬浮液与BSMV：TUB农杆菌悬浮液（含有BSMV的α、β、γ链，其中γ链携带小麦条锈菌TUB基因片段）扩繁病毒，5～7 d提取烟草汁液，接种2叶期小麦‘Local Red。接种病毒7 d即可对小麦材料的病毒接种叶进行RNA提取验证是否已经感染病毒。接种病毒10～12 d后对确定已感染BSMV：00与BSMV：TUB的小麦幼苗接种耐高温条锈菌株153234，同时接种未感染病毒的‘Local Red幼苗为空白对照。小麦幼苗接种条锈菌后在高温条件下（21±0.3）℃黑暗保湿24 h，转移至13～16℃的温室（L∥D=16 h∥8 h，光照强度8 000～12 000 lx）继续潜育培养，约16 d观察发病严重度以及夏孢子堆密度情况。

2 结果与分析

2.1 小麦品种在高温条件下接种条锈菌的严重度鉴定

本研究在高温（21±0.3）℃条件下接种条锈菌，保湿24 h后继续在13～16℃低温温室潜育培养约16 d，调查不同菌株接种供试小麦品种后小麦的发病严重度，确定各菌株的耐高温性水平，同时确定小麦品种的感病程度（表4）。经过分析比较，有11个小麦品种即‘NJ1194、‘Chinese Spring、‘辉县红、‘Thatcher、‘S110、‘Morocco、‘Chancellor、‘宁麦15、‘Local Red、‘扬麦12与‘扬麦18在高温条件下接种小麦条锈菌菌株后发病严重度较高，每个品种至少对4个耐高温条锈菌的严重度达到3～4级。同时发现，耐高温菌株153352、1415330、153234、140111与15463耐高温性水平较高，在高温接种条件下每个菌株至少引起7个供试品种发病严重度达到3～4级。其中，耐高温菌株153352在小麦品种‘辉县红、‘Thatcher、‘CBO37、‘S110、‘Morocco、‘Chancellor、‘宁麦15、‘Local Red、‘扬麦10号、‘扬麦12号以及‘扬麦18号上；153234在‘水源11、‘丰产3号、‘NJ1194、‘Chinese Spring、‘Morocco、‘Chancellor、‘Local Red、‘扬麦10号上；1415330在‘NJ1194、‘Chinese Spring、‘辉县红、‘Thatcher、‘扬麦6号、‘CBO37、‘S110、‘扬麦12、‘扬麦18上的发病严重度达到3～4级。

2.2 小麦品种对BSMV亲和程度分析

取初步筛选获得的11个小麦品种接种携带小麦PDS基因的BSMV：TaPDS，鉴定其对BSMV亲和性。接种重组病毒载体14 d左右部分小麦材料开始出现漂白褪绿症状，接种20 d左右小麦叶片漂白褪绿症状明显，统计出每个品种显症植株占总株数的百分比（表5）。根据统计结果，小麦品种‘NJ1194、‘Chinese Spring、‘宁麦15、‘Local Red、‘扬麦12以及‘扬麦18对BSMV亲和程度适合试验要求，当TaPDS基因被干涉后症状明显（图1）。

1） a： 漂白褪绿症状植株比例=显症株数/总株数×100%； b： 重复11，12和重复21，22分别表示第1次和第2次生物学重复的2次技术重复； c： 括号数字“2/9”表示“显症株数/测试总株数”，其他数据意义相同； d：“/”表示数据缺失。

a： Ratio of plants with photobleaching leaves=plants with photobleaching leaves / total plants×100%； b： Replicate 11， 12 and replicate 21， 22 represent two repetitional technical experiments including a first and a second biological replicates； c： 2/9 in bracket indicates： 2 plants with photobleaching leaves/9 total plants tested. Data in the other brackets follow the same rule； d： / indicates no data available.

结合供试品种在高温条件下接种小麦条锈菌菌株后发病严重度以及接种BSMV病毒后TaPDS基因的沉默效果，确定小麦品种‘Local Red与153352、153234等18个菌株；‘NJ1194与1415330、153234等7个菌株，‘扬麦12与153352、1415330等6个菌株；‘扬麦18与153352、1415330等6個菌株，‘Chinese Spring与1415330、153234等5个菌株，‘宁麦15与153352等4个菌株组成亲和（侵染型4型，严重度3～4级）互作组合（表6），可以用来进行条锈菌耐高温相关基因功能研究。特别是‘Local Red对供试的153352、153234等18个耐高温菌株表现为高度亲和，在高温条件下接种这些菌株后其发病严重度达到3级以上，并且与BSMV病毒亲和度较高，是利用HIGS方法验证条锈菌耐高温相关基因功能的理想材料。

2.3 利用HIGS技术干涉小麦条锈菌耐高温菌株TUB基因

以小麦品种‘Local Red与耐高温菌株153234组成互作组合，分析高温接种条件下干涉耐高温条锈菌菌株中TUB基因对条锈菌侵染发病的影响。与未接种病毒的空白对照Mock相比，感染携带空载体BSMV：00病毒的小麦幼苗叶片上的条锈菌侵染略受影响，发病严重度与孢子密度有所降低。进一步对比发现，当条锈菌TUB基因被干涉后，接种叶片发病严重度进一步降低，孢子堆数量更少，且夏孢子堆周围组织出现少量褪绿。说明当TUB基因被干涉后，高温条件下条锈菌的侵染过程明显受到了抑制（图3）。

3 讨论

研究表明，多数小麦品种具有不同程度的温敏微效基因调控的抗条锈性[10]，构建研究条锈菌耐高温相关基因功能的互作体系需要排除温敏微效抗性对试验结果的干扰。本研究首先筛选了20个常温条件下高感条锈病的小麦品种，研究了其与22个耐高温菌株的互作，发现其中‘Local Red、‘NJ1194、‘扬麦12、‘扬麦18、‘Chinese Spring以及‘宁麦15等11个品种在高温接种条件下呈现高严重度的侵染表型，结合接种BSMV：TaPDS后的显症情况，筛选出适合利用HIGS方法研究条锈菌耐高温相关基因功能的小麦品种‘Local Red与菌株153352和153234等互作组合。同时获得了153352、1415330和153234等一批耐高温性稳定且对上述品种具有高致病性的条锈菌菌株，为开展后续试验奠定了基础，也可为其他专性寄生真菌的相关试验提供参考。

高温条件下，接种空载体病毒的小麦植株与空白对照组相比条锈菌发病减弱，而实际常规接种温度下，两组材料发病没有明显差异。根据已有文献报道，BSMV病毒中3种RNA链即α、β、γ的比例会因为温度条件的不同而发生显著变化，致使感病植物中病毒含量改变[11]。推测一定范围内温度升高有利于病毒繁殖，影响了条锈菌的发病，致使高温条件下接种了空载体的试验组发病减弱。

试验发现，为提高小麦接种病毒的效率，扩繁病毒应使用8～10叶期的幼嫩烟草，烟龄过大则烟草内病毒繁殖量会大大降低。此外，烟草病毒汁液中保证有适量硅藻土或石英砂可以提高病毒接种效率，但摩擦剂的量过大可能使小麦幼苗受伤过重导致死亡。在病毒摩擦接种小麦的过程中，一只手固定小麦茎部，一只手轻柔地单向摩擦接种，可避免小麦根部被松动或者对叶片造成太大的机械伤害。

已有报道表明小麦品种‘Morocco与‘Thatcher均有易于观察到利用BSMV沉默目的基因的表型，可作为基因沉默的试验材料。但在研究中发现，‘Morocco接种病毒的成功比例较低且显症时间明显晚于其他小麦材料。两次重复试验中均没能观察到‘Thatcher叶片接种BSMV：TaPDS后产生漂白褪绿症状，但能检测到植株中的病毒RNA。因此，BSMV病毒载体对小麦品种‘Local Red基因沉默效率高于‘Morocco与‘Thatcher，更适合作为研究条锈菌耐高温相关基因功能的寄主材料。

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（责任编辑：田 喆）