铁皮石斛炭疽病病原菌的分离鉴定及其有效杀菌剂的筛选

赵玲琳 王国荣 沈伟东

摘要 铁皮石斛炭疽病是近年来发生在浙江铁皮石斛种植区的一种严重病害，主要危害石斛的叶片，形成圆形或近圆形并有凹陷的黄褐色或黑色叶斑，严重时叶片枯死，影响铁皮石斛的产量和质量。通过对铁皮石斛炭疽病典型症状样本的采集、病原菌的分离、纯化、致病性测定、形态观察、rDNA-ITS序列分析， 明确病原菌为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides。选择11种杀菌剂采用生长速率法对病原菌进行了药剂敏感性测定， 结果表明，6%春雷霉素可湿性粉剂 1 000倍液、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂1 000倍液对病菌抑菌效果接近100%。

关键词 铁皮石斛； 胶孢炭疽菌； 春雷霉素

中图分类号： S435.672

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018035

Abstract In recent years， anthracnose ofDendrobium officinale has become a serious disease inD. officinale producing areas of Zhejiang Province. It mainly infects the leaves and forms round or nearly round， dark brown or black sunken spots. In serious cases， it causes the leaves to wither. In this study， samples with typical disease symptoms were collected and then the pathogen was isolated and purified. Based on pathogenicity test， morphology observation and 16S rDNA-ITS sequence analysis， the pathogen was identified to beColletotrichum gloeosporioides. Moreover， the indoor inhibition activities of 11 kinds of fungicides were investigated by mycelial growth rate method. The results showed kasugamycin 6% WP 1 000 times and thiophanate-methyl 70% WP 1 000 times had strong inhibition action to the pathogen， with the inhibitory ratio close to 100%.

Key words Dendrobium officinale； Colletotrichum gloeosporioides； kasugamycin

鐵皮石斛Dendrobium officinaleKimuraet Migo是名贵中药材，被誉为“中华九大仙草”之首， 铁皮石斛中的多糖成分，具有提高人体免疫力、抗氧化和抗肿瘤的功效[1]。铁皮石斛野生资源稀少，随着对其需求量的增加，人工栽培铁皮石斛已相当普遍[2]。其中，大棚设施栽培是最主要的栽培模式，但大棚内高温高湿的环境，非常有利于病害的发生[3]。浙江省是铁皮石斛的主要种植区，产业化基地已超过100个， 种植面积高达2 000 hm.2，产值超过30亿元[2]。近年来，我们对浙江省铁皮石斛基地进行病虫害调查时发现，除了茎基部的茎腐病、白绢病、软腐病和疫病等病害外[3-6]，还有危害叶片的炭疽病、黑斑病[7]和叶斑病[8]等病害。我们在田间调查时发现青秆型铁皮石斛炭疽病叶发病率通常为25%，有的大棚达75%，严重影响铁皮石斛的产量与质量。在查阅文献时也发现炭疽病是铁皮石斛叶部的主要病害之一[9-10]， 据报道引起铁皮石斛炭疽病的病原菌有多种， 赵桂华等人[11]的研究表明引起江苏句容铁皮石斛炭疽病的病原菌是黑线炭疽菌Colletotrichum dematium， 李海明等[12]认为引起福建连城等地的铁皮石斛炭疽病是辣椒炭疽菌C.capsici， 邱道寿等[3]认为引起珠三角铁皮石斛炭疽病的病原菌是C.phalaenopsis 或胶孢炭疽菌C.gloeosporioides。上述除赵桂华等[11]对铁皮石斛炭疽病的病原菌作了详细研究外， 其余对炭疽病的病原菌尚未作过详细研究。为了明确引起浙江铁皮石斛炭疽病的病原菌， 更好地指导铁皮石斛生产与开展抗病育种研究，为铁皮石斛病虫害的绿色防控提供理论基础，本文着重就引起浙江省铁皮石斛炭疽病症状与病原鉴定进行研究。

1 材料与方法

1.1 病样采集及病原菌分离

2014-2016年连续在杭州市、温州市、金华市等铁皮石斛基地进行田间调查，采集叶片上出现黄褐色、黑色圆形或近圆形斑的铁皮石斛样本，装入干净样本袋中，带回实验室进行病原菌的分离。取病健交界处组织，置于75%乙醇中1 min，再用1% NaClO表面消毒3 min，然后重新置于75%乙醇中漂洗30 s，最后将组织块在无菌水中漂洗5次，用灭菌滤纸吸干水分并移入PDA平板上，25℃恒温培养箱内黑暗培养。待菌落长出后即从菌落边缘挑取极少量菌丝转接至新的PDA培养基上进行纯化，并在4℃冰箱内保存备用。

1.2 病原菌致病性测定

健康盆栽铁皮石斛苗由杭州正德农业开发有限公司提供，置于温室中，定时定量浇水和浇灌营养液，供致病性测定用。选择分离纯化得到的代表性菌株CG1在PDA培养基上培养1个月后，采用针刺加喷雾接种法进行接种试验：首先配制浓度为1 ×10.7个/mL的孢子悬浮液，再用针尖轻轻刺破石斛叶片表皮，造成微伤口，将含有吐温-20的孢子悬浮液以雾状喷洒于茎秆中间健康成熟叶片上，后用塑料袋套袋保湿48 h。每个处理接种5盆，每盆接种4枝茎，每枝茎6片叶片。对照组用无菌水代替孢子悬浮液。将接种后的植株置于人工气候培养室中（25℃，L∥D=12 h∥12 h，90%相对湿度）。定期观察发病情况并记录结果，待发病后从病组织处再次分离纯化病原菌。

1.3 病原菌的形态学特征观察

将分离纯化的菌株CG1，CG2，CG3，CG4和CG5在PDA平板上培养，在25℃黑暗人工气候箱内长满平板后，观察菌落形态特征，在显微镜下观察并记录其孢子形态特征，对病原菌进行形态学鉴定。

1.4 病原菌rDNA-ITS序列扩增及分析

采用基因组DNA快速抽提法提取病原菌基因组DNA[13]， 并进行PCR扩增。PCR采用核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）基因扩增通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。扩增反应体系：10×PCR 缓冲液（含Mg.2+）5 μL、10 mmol/L dNTP 1 μL、10 μmol/L引物ITS1和ITS2各1 μL、模板DNA 2 μL、5 U/mLTaq酶0.5 μL，加ddH2O至总体积50 μL，反应条件为95℃预变性2 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共进行35个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳回收目标DNA片段，由杭州擎科生物有限公司测序，测序结果用BLAST软件在GenBank上进行同源性比较。

1.5 病原菌室内药剂筛选

1.5.1 供试药剂及使用浓度

供试药剂详见表1。

1.5.2 平板抑菌试验方法

分别配制含表1农药浓度的PDA平板，用直徑为5 mm的打孔器打取病原菌菌落边缘菌饼，生长菌丝的一面朝下置于各含药PDA平板中央，以加无菌水的培养基为空白对照，每处理重复3次，置于25℃恒温培养箱内黑暗培养，于第5天以十字交叉法测量病原菌在含不同药剂的平板培养基上的菌落直径，与对照比较计算各药剂处理对菌丝生长抑制率。

菌丝生长抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%。

2 结果与分析

2.1 病害田间症状

铁皮石斛种植方式有露天栽培和设施栽培两大类，设施栽培有盆栽、地栽、床栽（架空苗床种植）等方式，浙江杭州、温州和金华等铁皮石斛基地90%以上是使用床栽方式种植的，有两层遮阴网、冬季还有一至二层薄膜覆盖，空气湿度保持80%以上，冬季不落叶，病害在田间可终年发生危害。而露天栽培铁皮石斛因冬季低温老叶基本落光，炭疽病发病明显轻于设施栽培，病菌以菌丝体或分生孢子在铁皮石斛被害部位或病残体上越冬，翌年条件适宜时产生分生孢子，通过风雨、农事操作将病原菌传播至健康叶片上，再产生病斑形成分生孢子不断重复侵染。调查了杭州、温州和金华等铁皮石斛基地发现，炭疽病是各铁皮石斛基地的主要叶部病害，浙江不同区域发病的严重度与症状基本相似。调查研究发现：浙江铁皮石斛炭疽病不仅可以危害当年移植的石斛苗，也危害2～3年生的石斛植株，高温高湿的梅雨季节和夏、秋高温季节是病害的高发期，在设施栽培地，株发病率达30%以上，有的成片死亡，在病害发生过的地方，补栽的石斛苗发病率可达50%以上。

该病害在石斛幼苗期（图1a）和成株期（图1b～c）都可以发生，病原菌侵染初期，叶片上出现淡黄色至黄褐色圆形或近圆形病斑（图1b）。病斑一般从近茎基部的老叶上开始出现，逐步向茎上部蔓延扩展。在病害发生后期，病斑呈黑色或黑褐色且略有下陷，直径可达5 mm（图1c）。在相对湿度较大时，病斑上会产生灰褐色的分生孢子堆。

2.2 病原菌分离及致病性测定

从浙江杭州、温州和金华采集的病叶上共分离纯化出5株菌株CG1、CG2、CG3、CG4和CG5，菌株CG1、CG2分离自杭州正德农业科技有限公司萧山铁皮石斛基地采集的样本，菌株CG3、CG4分离自金华市义乌铁皮石斛基地采集的样本，菌株CG5分离自温州市乐清铁皮石斛基地采集的样本，这5株菌在PDA上的生长速度与菌落形态特征一致。在生长初期，气生菌丝白色，后逐渐变为青灰色至深灰色，菌丝呈絮状，短而致密。背面有明显的同心轮纹。选取CG1作为代表性菌株进行盆栽接种试验，结果表明：孢子悬浮液喷雾接种5 d后，可见黄色圆形病斑出现，大多数为针尖大小（图1d）。三周后可在多数接种孢子的处理叶片上看到明显黑色圆形病斑（图1e），略有凹陷。以无菌水接种的对照未见病斑。分离并纯化受侵染叶片组织的病原物，得到形态学上与CG1相同的病原菌。

2.3 分离菌株的菌落与形态学特征

菌株CG1、CG2、CG3、CG4和CG5在PDA培养基上的菌丝密集，呈絮状。菌落生长初期为白色，后变为青灰色至深灰色（图1f），背面中心黑色，外围灰色，菌落呈同心轮纹状生长（图1g），10 d可长满直径为9 cm的平板。一个月后，可在菌落的表面及内部形成黑色、凸起的分生孢子堆（图1h）。显微镜下分生孢子长椭圆形（图1i），菌丝壁光滑（图1j），分生孢子大小为（9.18～14.11）μm×（4.02～6.64）μm，平均为12.23 μm×4.89 μm。

2.4 病原菌分子生物学特征

铁皮石斛炭疽病病原菌菌株CG1～CG5的rDNA-ITS序列长度均为580 bp，GenBank登录号依次为MF939643、MF939644、MF939645、MF939646、MF939647。用BLAST软件在GenBank中与相近的其他病原菌比对，结果表明，菌株CG1～CG5的rDNA-ITS序列均与GenBank中菌株号为KF053200.1、KY962993.1和KM013432.1的胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides具有99%的相似性。通过系统发育树分析表明，铁皮石斛炭疽病病原菌与胶孢炭疽菌同源性最高，位于系统发育树的同一分支，支持率为65%（图2）。结合铁皮石斛炭疽病病原菌形态特征，根据rDNA-ITS序列分析结果，将铁皮石斛炭疽病病原菌确定为胶孢炭疽菌。

2.5 病原菌室内药剂筛选

由表1可知，在平板药剂筛选试验中，抑菌效果最好的是6%春雷霉素可湿性粉剂1 000倍液和70%甲基硫菌灵可湿性粉剂1 000倍液，抑菌率均达到了96%以上。然后依次是10%苯醚甲环唑可湿性粉剂1 500倍液、99%恶菌灵原药3 000倍液、25%吡唑醚菌酯乳油2 000倍液、50%嘧菌环胺水分散粒剂750倍液、29%吡萘嘧菌酯悬浮剂1 500倍液、42.8%氟菌肟菌酯悬浮剂3 500倍液、224%啶氧菌酯悬浮剂1 500倍液、1 000亿/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂2500倍液。24%噻呋酰胺悬浮剂2 000倍液对胶孢炭疽菌抑制率最差，只有66%。

3 结论与讨论

本研究对引起浙江杭州、温州和金华等铁皮石斛炭疽病的病原菌进行了分离与鉴定，将分离到的病原菌用柯赫氏法则进行盆栽接种试验，分离到的菌株所引起的病害症状与田间石斛叶部病害症状一致，并且从发病的叶片组织上再次分离到该病原菌。经致病性试验、病原菌形态学特征观察、rDNA-ITS序列分析，结合田间症状观察，明确引起浙江省铁皮石斛炭疽病的病原菌是胶孢炭疽菌。张翊等人[14]认为引起贵州赤水金钗石斛炭疽病的病原也为胶孢炭疽菌，但文中对症状没有描述，对病原菌的致病性没有测定。王晓阳从金钗石斛上分离到引起炭疽病的病原菌为博宁炭疽菌C.boninense.[15]，据作者描述博宁炭疽菌在金钗石斛上引起的病害症状类似疫病，病害从茎基部或根部开始发病，后病部软化并蔓延至其他部位，這个症状与我们在田间观察到的症状有很大差异，在浙江杭州、金华和温州等多家铁皮石斛基地都未曾观察到炭疽病从茎基部或根部开始发病，我们观察到的症状主要在叶片上引起叶斑。浙江炭疽病的症状与赵桂华等[11]描述的由黑线炭疽菌C.dematium引起的江苏句容铁皮石斛炭疽病症状、李海明等[12]描述的由辣椒炭疽菌C.capsici引起的福建连城等地的铁皮石斛炭疽病症状以及邱道寿等[3]描述的由C.phalaenopsis引起的珠三角铁皮石斛炭疽病症状均相似。说明石斛炭疽病由不同种炭疽菌引起，从症状上难以区别，抗病育种工作者应针对当地主要病原种群进行育种。

本次试验测定了11种杀菌剂对铁皮石斛炭疽病病原菌的抑菌效果，结果表明春雷霉素和甲基硫菌灵对病菌的抑制效果较好，苯醚甲环唑、恶菌灵等也有一定的抑制效果，而枯草芽孢杆菌和噻呋酰胺对该病菌基本没有抑制作用。测定结果为铁皮石斛炭疽病的田间药剂试验提供基础，由于本试验是在室内完成，所以在田间病害防控推广前，还需开展田间药剂试验，此外，还应考虑药剂成本及对铁皮石斛生长和生态环境的影响，力求施用高效低毒、低残留和低成本的药剂。铁皮石斛是名贵的中药材，在栽培管理过程中应尽可能减少化肥与农药的使用，加强生产与科研单位的合作与配合，从病原学和病害流行学入手，研究明确病害发生流行规律，找出关键防治时期，开展绿色生态防控研究，保障石斛种植产业健康持续发展。

参考文献

[1] 郭冕，江吉富.石斛多糖药理作用的研究概况[J].医学综述，2015，21（24）：4525-4528.

[2] 何伯伟，潘慧锋.浙江铁皮石斛产业提升发展的实施措施与建议[J].浙江农业科学，2014（2）：152-155.

[3] 邱道寿，刘晓津，郑锦荣，等.棚栽铁皮石斛的主要病害及其防治[J].广东农业科学，2011（S1）：118-120.

[4] 王国荣，沈卫东，孙超，等.铁皮石斛茎基部2种主要病害病原菌的分离与鉴定[J].植物保护，2017，43（1）：168-172.

[5] 曹星星.铁皮石斛病原真菌分离与鉴定及印度梨形孢促生作用[D].杭州：浙江大学，2015.

[6] 李静，张敬泽，吴晓鹏，等.铁皮石斛疫病及其病原菌[J].菌物学报，2008，27（2）：171-176.

[7] 张敬泽，郑小军.铁皮石斛黑斑病病原菌的鉴定和侵染过程的细胞学研究[J].植物病理学报，2004，34（1）：92-94.

[8] SUN Chao， WANG Ting， SHEN Xiaoling， et al. First report of leaf spot caused byCladosporium cladosporioides onDendrobium officinale in China [J]. Plant Disease， 2017， 101（6）：1055.

[9] 卢振辉，李明焱，王伟杰，等.铁皮石斛主要病虫害及其非化学农药防治[J].浙江农业科学，2016，57（1）：123-126.

[10]李景蕻，张丽华.铁皮石斛种苗生产中4种常见病害及防治[J].种子，2015，34（12）：128-130.

[11]赵桂华，赵楠.铁皮石斛叶斑病新病原-黑线炭疽菌的分离鉴定及致病性测定[J].西部林业科学，2016，45（3）：20-25.

[12]李海明，王伟英，林江波，等.大棚铁皮石斛主要病害的发生与防治[J].中国园艺文摘，2017（6）：223-224.

[13]CHI M H， PARK S Y， LEE Y H. A quick and safe method for fungal DNA extraction[J]. Journal of Plant Pathology， 2009， 25（1）：108-111.

[14]张翊，桑维钧，梁郡驿.金钗石斛炭疽病病原鉴定及杀菌剂毒力测定[J].湖北农业科学，2014，53（14）：3307-3309.

[15]王晓阳.14种观赏植物17种真菌病害的病原鉴定[D].广州：华南农业大学，2016.

（责任编辑：杨明丽）