葡萄卷叶伴随病毒1号和3号宁夏分离物部分基因序列分析

吕苗苗　李文学　孙牧笛　胡丽杰　顾沛雯

摘要

為明确葡萄卷叶伴随病毒（GLRaVs）在宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄上的侵染状况，采用RTPCR技术对40份酿酒葡萄样品中的GLRaV1～GLRaV5进行了外壳蛋白（CP）、复制酶（RdRp）和热激蛋白（HSP70）基因序列的克隆和分析。检测结果表明，在所检测的5种病毒中，除GLRaV2和GLRaV4未检测到外，GLRaV1和GLRaV3的检出率最高，分别为20.0%和32.5%，GLRaV5的检出率仅为5.0%；有6个样品存在GLRaV1和GLRaV3两种病毒复合侵染。序列分析表明，GLRaV1宁夏分离物的部分CP基因序列长度为232 nt，其两种分离物间的核苷酸序列同源率为90%，与已报道的国内外其他分离物CP基因序列相比，其同源率为90%～99%；GLRaV3宁夏分离物的CP基因序列长度为942 nt，其两种分离物间的核苷酸序列同源率为40%，与已报道的国内外其他分离物CP基因序列相比，其同源率为40%～99%；GLRaV3宁夏分离物的RdRp基因序列长度为683 nt，其各分离物间的核苷酸序列同源率为90%以上，与已报道的国内外其他分离物RdRp基因序列相比，其同源率为90%～99%；GLRaV3宁夏分离物的HSP70基因序列长度为546 nt，其两种分离物间的核苷酸序列同源率为96%，与已报道的国内外其他分离物HSP70基因序列相比，其同源率为96%～99%。

关键词

葡萄卷叶伴随病毒（GLRaVs）； RTPCR检测； 克隆； 序列分析

中图分类号：

S 436.631

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017187

Sequence analysis of the genes of Grapevine leafrollassociated

viruses 1 and 3 from Ningxia isolates

L Miaomiao， LI Wenxue， SUN Mudi， HU Lijie， GU Peiwen

（College of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）

Abstract

To understand the infection status of Grapevine leaf rollassociated virus in wine grapes grown in Helan Mountain East Region of Ningxia， RTPCR was used to clone the coat protein （CP）， replication enzyme （RdRp） and heat shock protein （HSP70） gene sequences of Grapevine leaf rollassociated virus 15 in 40 wine grape samples and gene sequence analysis was conducted. The results showed that the detection rate of GLRaV1 and GLRaV3 in all samples was 20.0% and 32.5%， respectively， but the detection rate of GLRaV5 was only 5.0%； in addition， GLRaV2 and GLRaV4 were not detected in the samples， GLRaV1 and GLRaV3 showed compound infection in six samples. The sequence analysis showed that each partial sequence of GLRaV1CP gene of the two isolates was 232 nt long and their nucleotide sequence homology was 90%， and their nucleotide sequence homology with those of previously reported isolates was 90%-99%. Each of the complete sequence of GLRaV3CP gene of the two isolates was 942 nt long， sharing a nucleotide sequence homology of 40%. Their nucleotide sequence homology with those of previously reported isolates was 40%-99%. Each of the complete sequence of GLRaV3RdRp gene of the three isolates was 683 nt long， sharing a nucleotide sequence homology of 90%， and their nucleotide sequence homology with those of previously reported isolates was 90%-99%. Each of the complete sequence of GLRaV3HSP70 gene of the two isolates was 546 nt long， sharing a nucleotide sequence homology of 96%， and their nucleotide sequence homology with those of previously reported isolates was 96%-99%.

Key words

Grapevine leafrollassociated virus （GLRaVs）； RTPCR detection； cloning； sequence analysis

葡萄卷叶病（grapevine leafroll disease，简称GLRD）是世界范围内分布最广，造成损失最大的一种葡萄病毒病，已成为世界葡萄栽培地区生产中的严重问题。现已研究表明，引起该病的病原是葡萄卷叶伴随病毒Grapevine leafrollassociated viruses，简称GLRaVs，该类病毒目前已查明共有11种，包括GLRaV1～GLRaV9、GLRaVPr和GLRaVDe，这些病毒在血清学和分子生物学上互不相关，单独或复合侵染葡萄均可导致卷叶病的发生[1]。

目前，国内发现至少有10种GLRaVs与该病相关，其中GLRaV1～GLRaV5是造成葡萄卷叶病的主要病原[2]，且复合侵染现象比较普遍[3]。这5种病毒均属长线形病毒科Closteroviridae，其基因组为正单链RNA， GLRaVs全长约12～19 kb，由8～13个开放阅读框（ORF）组成，其中GLRaV1基因组和GLRaV3基因组分别包括10个主要的ORF和13个ORF，主要编码类木瓜蛋白酶（PPro）、甲基转移酶（MTR）、螺旋酶（HEL）、复制酶（RdRp）、热激蛋白（HSP70）、外壳蛋白（CP）和重复的外壳蛋白（CPd）及几种功能未知的蛋白。由于在葡萄树中病毒含量通常较低，因此灵敏度高、特异性强的逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，簡写RTPCR）在这几种病毒检测中应用广泛。

宁夏贺兰山东麓是国内公认的种植酿酒葡萄的最佳生态区，近年来，由于葡萄种植新区的建立和栽培面积的扩大，葡萄品种繁殖材料在各地的引进和输出也日益频繁，造成葡萄卷叶病危害猖獗。2015年，在贺兰山东麓的新牛和新惠彬酒庄葡萄园中，‘蛇龙珠品种葡萄卷叶病田间自然发病率分别达85.1%和52.7%，个别果园发病率甚至达到100%[4]。因此，本研究借鉴了国内外有关GLRaVs在CP、RdRp、HSP70基因克隆和序列分析方面的研究结果，进行宁夏GLRaVs分离物的分子检测和序列比对分析，目的是评判宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄的健康状况，为减少GLRaVs在该区域的传播和蔓延提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

参试酿酒葡萄品种材料来自贺兰山东麓8个主要的葡萄产地，分别为宁夏永宁县玉泉营农产新惠彬酒庄、农垦东大滩酿酒葡萄基地、农垦南大滩酿酒葡萄基地和闽宁镇立兰酒庄；银川市金凤区广夏三基地和森淼兰月谷酒庄；银川市西夏区新牛酒庄和志辉源石酒庄。

供试品种为‘赤霞珠（‘Cabernet Sauvignon）、‘蛇龙珠（‘Cabernet Gernischt）、‘黑比诺（‘Pinot Noir）、‘霞多丽（‘Chardonnay）、‘品丽珠（‘Cabernet Franc）、‘美乐（‘Merlot）、‘西拉（‘Shiraz）和‘威代尔（‘Vidal）。

1.2 采样方法

采集样品在酿酒葡萄栽培园和葡萄品种园进行。随机选择单株，每个单株剪取6～10片叶及5～10个枝条，嫩叶片采集于树体上部枝条第3～5节上，老叶片采集于下部枝条第5节以后；嫩枝条采集于未木质化的上部新梢，老枝条采集于下部已木质化的枝条；嫩叶柄为嫩叶片的叶柄，老叶柄为老叶的叶柄。将样品立即用锡箔纸包好，注明采集日期、地点、品种、品种来源、种植面积等，置于液氮罐中，室内于-80℃冰箱中保存，备用。

1.3 GLRaVs分子检测

1.3.1 引物序列

根据文献[510]，设计GLRaV1～GLRaV5的特异性引物，引物序列如表1。

1.3.2 RNA提取

称取葡萄叶柄、枝条韧皮部组织100 mg，加入液氮迅速研磨至粉末状，并将粉末转移到1.5 mL的离心管中，按照OMEGA提取RNA试剂盒（美国OMEGA公司）使用说明书进行总RNA的提取。

1.3.3 RTPCR检测

提取出的总RNA采用反转录试剂盒（北京全式金生物有限公司）反转录成cDNA，每个反应体系为20 μL，先加入总RNA 4 μL、OligDT18Primer 1 μL、RNasefree Water 3 μL置于65℃温浴5 min，取出冰浴2 min；再加入2×TS Reaction Mix 10 μL、TransScriptTMRT 1 μL、gDNA Remover 1 μL，轻轻混匀，于42℃孵育30 min，之后经85℃加热5 s，失活TransScriptTMRT和gDNA Remover，即可得到所需的cDNA。

采用设计的特异性引物GLRaV1～GLRaV5对样品中病毒进行检测。PCR扩增反应体系25 μL：总DNA 2 μL，正向、反向引物各2 μL，Max Taq酶25 μL，RNasefree Water 18 μL；PCR扩增条件：94℃ 3 min，94℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃ 1 min，35个循环，72℃ 10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测产物。PCR产物由武汉昆泰公司进行测序。

1.4 GLRaV1和GLRaV3宁夏分离物部分基因组的系统进化分析

从GenBank中获得4个不同地理来源的GLRaV1分离株CP基因序列，分别为中国辽宁分离物GSITRI1（KP067351）和BJMuH（KP067359）、美国分离物CA22（JF811849）和加拿大分离物WC429（EF103902）；5个不同地理来源的GLRaV3分离株CP基因序列，分别为中国北京分离物YN1（KC477181）、四川分离物SL10（DQ911148）和湖北分离物Dawanhong NO.2（DQ119574）、美国分离物WAMR（GU983863）和智利分离物TRAJBR（KX756669）。4个不同地理来源的GLRaV3分离株RdRp基因序列，分别为中国北京分离物LN（JQ423939）、湖北分离物GLRaV3AYHB（AY495340）、意大利分离物CN4151（GU812895）和南非分离物621（GQ352631）；4个不同地理来源的GLRaV3分离株HSP70基因序列，分别为中国辽宁分离物GLRaV3GQLN（GQ246623）和L1（GQ478313）、美国分离物VAFL049（KF417602）和智利分离物4262LR3（HM636879）。小樱桃病毒Little cherry virus（简称LChV）作为同属的外组病毒，分别为法国分离物PR2910（KT347315）、波兰分离物C14（EU153101）、美国分离物Jeju63（KP410831）和美国分离物LChVAYMG（AY944067）。

利用DNAMAN5.2.2软件进行多重比对（Clustal W方法），分析不同分离株间的核酸序列相似性。邻接法（设定1 000重复值的bootstrap评估遗传距离分支的可信度）构建不同地理起源分离株的系统进化树。

2 结果与分析

2.1 总RNA质量及RTPCR检测结果

由图1a可知，酿酒葡萄总RNA有两条清晰明亮带，分别为28S rRNA和18S rRNA。紫外分光光度计测得OD260/OD280比值约为2.15，表明所提取的总RNA完整性和纯度较好。以此为模板，采用RTPCR分别检测GLRaV1～GLRaV5的CP基因序列与GLRaV3的HSP70和RdRp基因序列。结果表明，GLRaV1部分CP基因和GLRaV3的CP基因扩增产物条带片段大小分别为230 bp和940 bp左右，与预期的GLRaV1和GLRaV3的CP基因序列大小相符（图1b和c），初步定名为GLRaV1CPNX和GLRaV3CPNX（宁夏分离物）。采用GLRaV3的HSP70和RdRp基因特异性引物对宁夏分离物进行RTPCR检测，获得的扩增产物片段大小分别为540 bp和680 bp左右，与预期的GLRaV3的HSP70和RdRp基因序列大小相符（图1d和e），且检测结果与GLRaV3的CP基因阳性率一致。初步定名为GLRaV3HSP70NX和GLRaV3RdRpNX（宁夏分离物）。GLRaV5的CP基因扩增产物条带片段大小为690 bp左右，与预期的GLRaV5的CP基因序列大小相符（图1f），初步定名为GLRaV5CPNX（宁夏分离物）。

2.2 GLRaV1CPNX核苷酸序列的分析比较

将8个GLRaV1宁夏分离物的CP基因的核苷酸序列与NCBI中注册的序列进行同源性比对，发现共有2种不同的宁夏分离物GLRaV1CPNX，CP基因序列长度均为232 nt，分别定名为GLRaV1CPNX1和GLRaV1CPNX2，其比例为3∶1。根据已报道的4个不同地理来源的GLRaV1CP序列作为参照，建立系统进化树。

由图2可知，两种宁夏分离物GLRaV1CPNX1和GLRaV1CPNX2的核苷酸序列相似性为90%，分别聚在2个分支中，其中GLRaV1CPNX1与中国辽宁分离物GSITRI1（KP067351）序列相似性最高，为99%，其次与美国分离物CA22（JF811849）的相似性为97%；与加拿大分离物WC429（EF103902）的相似性95%。宁夏分离物GLRaV1CPNX2与中国辽宁另一分离物BJMuH（KP067359）的相似性较高，为99%，而与美国分离物CA22（JF811849）和加拿大分离物WC429（EF103902）和中国辽宁分离物GSITRI1（KP067351）的相似性较低，分别为92%、91%和90%。2个GLRaV1宁夏分离物CP基因序列与小樱桃病毒法国分离物PR2910（KT347315）的相似性均存在较大差异，一致性均为40%。说明GLRaV1宁夏分离物存在着分子变异，在宁夏至少存在2株变异株系。

2.3 GLRaV3CP（RdRp和HSP70）NX核苷酸序列的分析比较

将13个GLRaV3宁夏分离物的CP、RdRp和HSP70基因的核苷酸序列与NCBI中的同源序列进行比对，发现共存在2种不同的CP基因序列，分别定名为GLRaV3CPNX1和GLRaV3CPNX2，GLRaV3 CP基因序列长度均为942 nt；3种不同的RdRp基因序列，分别定名为GLRaV3RdRpNX1、GLRaV3RdRpNX2和GLRaV3RdRpNX3，GLRaV3 RdRp基因序列长度均为683 nt；2种不同的HSP70基因序列，分别定名为GLRaV3HSP70NX1和GLRaV3HSP70NX2，GLRaV3 HSP70基因序列长度均为546 nt。根据已报道的不同地理来源的GLRaV3的CP、RdRp和HSP70基因序列作为参照，建立系统进化树。

由图3a可知，GLRaV3CPNX1和GLRaV3CPNX2的核苷酸序列相似性为40%，分别聚在2个分支中，其中GLRaV3CPNX1与国内的北京分离物YN1（KC477181）、四川分离物SL10（DQ911148）和湖北分离物Dawanhong NO.2（DQ119574）及国外的美国分离物WAMR（GU983863）、智利分离物TRAJBR（KX756669）的相似性达到99%。而GLRaV3CPNX2与国内外的分离物的一致性均较低，仅为40%。GLRaV3CPNX1和GLRaV3CPNX2均与小樱桃病毒波兰分离物C14（EU153101）存在较大差异，相似性分别为46%和40%。

由图3b可知，GLRaV3RdRpNX1、GLRaV3RdRpNX2和GLRaV3RdRpNX3的核苷酸序列相似性为90%以上，分别聚在3个分支中，其中GLRaV3RdRpNX1与GLRaV3RdRpNX2的相似性较高，为96%，与GLRaV3RdRpNX3的相似性较低，为93%。GLRaV3RdRpNX1与国内湖北分离物GLRaV3AYHB（AY495340）和南非分離物621（GQ352631）的相似性较高，为98%，与意大利分离物CN4151（GU812895）和北京分离物LN（JQ423939）的相似性分别为93%和90%。GLRaV3RdRpNX2与北京分离物LN（JQ423939）的相似性为90%，与其他分离物的相似性均在96%左右。GLRaV3RdRpNX3与意大利分离物CN4151（GU812895）的相似性较高，为98%，与其余国内外分离物的相似性均在94%左右。而3个GLRaV3宁夏分离物RdRp基因序列与小樱桃病毒美国分离物Anning26（HQ412772）均存在较大差异，相似性均为40%。

由图3c可知，GLRaV3HSP70NX1和GLRaV3HSP70NX2的核苷酸序列相似性为96%，分别聚在2个分支中，其中GLRaV3HSP70NX1与国内的辽宁分离物GLRaV3GQLN（GQ246623）、L1（GQ478313）和國外的美国分离物VAFL049（KF417602）、智利分离物4262LR3（HM636879）的相似性均达到98%，而GLRaV3HSP70NX2与4种国内外的分离物的相似性为96%左右。2个GLRaV3宁夏分离物HSP70基因序列与小樱桃病毒美国分离物LChVAYMG（AY944067）均存在较大差异，相似性均为44%。

综上所述，GLRaV3宁夏分离物的CP、RdRp存在较大的分子变异，推测GLRaV3宁夏分离物可能存在2～3个变异类型。

3 讨论

本研究主要对宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄种植区的5种GLRaVs（GLRaV1～GLRaV5）进行RTPCR检测。除了GLRaV2和GLRaV4未检测到外，其余3种GLRaVs均被检测到，且GLRaV1和GLRaV3的检测率较高，分别为20.0%和32.5%，说明造成贺兰山东麓地区酿酒葡萄出现卷叶病症状的主要病原为GLRaV1和GLRaV3。在检测的40份样品中，有6份样品存在GLRaV1和GLRaV3的复合侵染，主要表现在种植18～20年的‘蛇龙珠、‘黑比诺、‘品丽珠、‘赤霞珠和‘霞多丽品种上。由此可见，随着种植年限的增加，GLRaVs的复合侵染现象越发的明显，同时也会引起GLRaVs的分子变异。GLRaVs主要通过苗木调运和接穗的嫁接进行传播[23]，生产上需要加强引进苗木的葡萄卷叶病的检测力度，切断葡萄卷叶病的嫁接传播途径，从根本上杜绝葡萄卷叶病的危害。

通过对宁夏分离物GLRaV1CPNX的CP基因的同源性比对，发现两种不同的宁夏分离物（GLRaV1CPNX1和GLRaV1CPNX2），分别与辽宁分离物GSITRI1和BJMuH的同源性较高，确定为相同株系。国内外对GLRaV1的CP基因分子变异有一定的研究。2013年Esteves等[24]对葡萄牙的20个GLRaV1分离物的CP基因进行序列分析，证明GLRaV1的CP基因内部存在不同变异株系的基因重组。2015年Fan等[25]对中国43个GLRaV1分离物的CP和HSP70基因进行序列分析，结果显示大部分突变种与从‘Beta植株上获得的分离物同属一组，推测该部分变异种是由携带GLRaV1变种的‘Beta砧木嫁接传播导致的。宁夏酿酒葡萄发展迅速，据报道在宁夏酿酒葡萄发展的初期，曾经大量从我国东北地区引进‘Beta等山葡萄品种作为砧木与欧亚种如‘赤霞珠、‘品丽珠和‘蛇龙珠等进行嫁接，可能经过长期的突变积累，导致GLRaV1不同变异株的复合侵染，通过基因重组在现有栽培上出现了不同的变异株。

本文将GLRaV3宁夏分离物的CP、RdRp和HSP70基因与NCBI中登记的序列进行同源性比对，发现GLRaV3的CP和RdRp基因序列存在较大的分子变异，可以认为宁夏存在由于CP基因和RdRp基因突变而形成的GLRaV3新的变异株系，其中，GLRaV3CPNX2是由GLRaV1和GLRaV3复合侵染的酿酒葡萄‘蛇龙珠中获得，该分离物表现出较大的差异性，由此可以推测是一种新的变异种。由于植物病毒本身的RNA聚合酶缺乏严密的校对修正功能，使得其在宿主体内形成由一个主序列和与该序列相关的大量突变体集合的病毒种群，称为准种病毒（quasispecies）。2005年Turturo等[26]研究发现GLRaV3的不同变异种的复合侵染严重，表明结构多样性的葡萄卷叶病毒种群是准种病毒。2013年Farooq等[27]和Liu等[28]对GLRaV3中国分离物进行多样性分析，结果显示CP基因是GLRaV3基因重组较活跃的区域，不同变异种的基因重组形成了新的变异种。葡萄较长的生长周期、无病毒苗木检测技术的缺乏、病毒的基因突变以及不同变异株系的复合侵染为基因重组与进化提供了必要的条件。由于我国葡萄病毒病的研究起步较晚，葡萄病毒病原方面的研究较少，而葡萄病毒病对葡萄产业的影响较大，因此，我们有必要在加强对这些病毒病原研究的同时，加强对葡萄病毒病检测技术的优化和无毒苗木的培育工作，为宁夏酿酒葡萄病毒病的监控提供技术支持。

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（責任编辑：田 喆）